植物生物技术杂志 （2012） 10，第 139-149 页 doi： 10.1111/j.1467-7652.2011.00637.x
植物生物技术杂志 （2012） 10，第 139-149 页 doi： 10.1111/j.1467-7652.2011.00637.x

OsPIN2 的过表达通过抑制 OsLAZY1 导致分蘖数、角度增加和株高缩短
OsPIN2 的过表达通过抑制 OsLAZY1 导致分蘖数、角度增加和株高缩短

陈英楠^†， 范晓荣^†、宋文静、张雅丽和徐国华*
陈英南 ^†、范晓荣 ^†、宋文静、张雅丽和徐国华*

南京农业大学资源与环境科学学院， 作物遗传与种质改良国家重点实验室， 南京，
南京农业大学资源与环境科学学院， 作物遗传与种质改良国家重点实验室， 南京，

中国
中国

2011 年 2 月 11 日接收;2011 年 5 月 21 日修订;2011 年 6 月 11 日接收。*通信（电话 ⁄ 传真 +0086 25 84396246;电子邮件 ghxu@njau.edu.cn） † 这些作者对这项工作做出了同等贡献。
2011 年 2 月 11 日接收;2011 年 5 月 21 日修订;2011 年 6 月 11 日接收。*通信（电话传真 +0086 25 84396246;电子邮件 ghxu@njau.edu.cn） 这些作者对这项工作做出了同等贡献。

关键词：生长素外排转运蛋白 /
关键词：生长素外排转运蛋白 /

水稻，OsLazy1，OsPIN2，OsTAC1，植物结构。
水稻，OsLazy1，OsPIN2，OsTAC1，植物结构。

总结
总结

介绍
介绍

植物激素生长素 [（吲哚-3-乙酸 （IAA）] 是许多植物发育过程的重要调节因子，包括胚胎发生、根模式、维管组织分化、顶端优势、向光性、向重力和其他生理过程（Friml 等人，2003 年;Mattsson 等人，2003 年;Kimura 和 Kagawa，2006 年;Palme et al.， 2006）。生长素主要在叶、原始叶和幼叶中合成，并定向运输到根尖。在细胞水平上，生长素的定向运输是由不同生长素膜载体的不对称分布引起的，包括内流载体 AUX1 蛋白家族（Bennett等人，1996 年）、促进外排的 PIN 形成 （PIN） 家族成员（Friml等人，2003 年;Blilou等人，2005 年）和许多 p-糖蛋白 ABC 转运蛋白（Geisler 和 Murphy，2006 年）。据报道，PIN 在催化生长素从细胞中流出中起限速作用，它们的不对称细胞定位决定了细胞间流动的方向，这是生长素调节生长过程的核心（Petra'sek等人，2006 年）。
植物激素生长素 [（吲哚-3-乙酸 （IAA）] 是许多植物发育过程的重要调节因子，包括胚胎发生、根模式、维管组织分化、顶端优势、向光性、向重力和其他生理过程（Friml 等人，2003 年;Mattsson 等人，2003 年;Kimura 和 Kagawa，2006 年;Palme et al.， 2006）。生长素主要在叶、原始叶和幼叶中合成，并定向运输到根尖。在细胞水平上，生长素的定向运输是由不同生长素膜载体的不对称分布引起的，包括内流载体 AUX1 蛋白家族（Bennett 等人，1996 年）、促进外排的 PIN 形成 （PIN） 家族成员（Friml 等人，2003 年;Blilou 等人，2005 年）和许多 p-糖蛋白 ABC 转运蛋白（Geisler 和 Murphy，2006 年）。据报道，PIN 在催化生长素从细胞中流出中起限速作用，它们的不对称细胞定位决定了细胞间流动的方向，这是生长素调节生长过程的核心（Petra'sek 等人，2006 年）。

已在拟南芥的基因组中鉴定出 8 个 PIN 基因，从 AtPIN1 到 AtPIN8。每个成员都显示出独特的组织特异性表达模式和亚细胞定位 （Friml等人，2003 年;Blilou et al.， 2005;Paponov et al.， 2005）。pin1 突变体表现出 pin 状花序和维管组织发育缺陷（Okada等人，1991 年;Ga ̈elweiler et al.， 1998）。PIN2 中的突变显示嗜重力根生长表型（Chen等人，1998 年;Mu ̈ ller et al.， 1998;Shin et al.， 2005）。PIN2 部署在通过根分生组织和伸长区的外围层向生长素传递中起关键作用（Muday 和 Rahman，2008）。有人提出，向根 PIN2 和 PIN1 对向根重定位具有不同的敏感性 （Rahman et al.， 2010）。其他同源物 PIN3、PIN4 和 PIN7 似乎分别在趋向性、根分生组织模式和建立胚胎极性中发挥作用（Friml 等人，2002a，b，2003 年;Blilou et al.， 2005）。水稻基因组包含 12 个推定的 PIN 基因 （Wang et al.， 2009），包括 4 个 PIN1 基因 （命名为 OsPIN1a-1d）、OsPIN2、3 个 PIN5 基因 （OsPIN5a-c）、OsPIN8 和 3 个单子叶植物特异性 PIN 基因 （OsPIN9、OsPIN10a 和 OsPIN10b）。水稻中 RNA 干扰 （RNAi） 对 OsPIN1b 表达的抑制显示出抑制不定根出现和发育的表型 （Xu et al.， 2005）。

生长素在水稻中的独特作用是控制分蘖角（McSteen， 2010）。对于单子叶作物，分蘖角是一个重要的农艺性状，已被考虑用于育种计划（Wang 和 Li， 2005）。蘖柄角的调节是环境因素和激素稳态的结合（Myers et al.， 1994;Li et al.， 2007;Yu et al.， 2007）。据报道，水稻分蘖的角度与水稻叶鞘基部的引力相关（Abe et al.， 1996;胡等人，2007 年）。据报道，OsTAC1 在控制水稻结构中起关键作用。OsTAC1 的高表达导致较宽的分蘖角和更多的分蘖，而低表达导致直立的分蘖角较小（Yu et al.， 2007）。Xu 等人（2005 年）报道了 OsPIN1b RNAi 突变水稻植株的分蘖角度更大，分蘖更多，而

OsPIN1b 过度表达的线条。这些作者证明 OsPIN1b 促进了生长素的运输;因此，RNAi 突变体增加了分蘖角。然而，OsLazy1 的突变，一种在极性生长素运输中起负作用的草特异性基因，也增加了水稻的分蘖角（Li et al.， 2007;Yoshihara 和 Iino，2007 年）。因此，极性生长素转运是促进还是抑制水稻的分蘖角仍然是一个重要的问题。

我们使用 OsPIN2 （AK101191） 的转基因过表达（AtPIN2 的唯一水稻同源物）来表明植物具有相似的表型，分蘖角增加，分蘖更多，不定根更少，就像 OsPIN1b 抑制突变体一样。此外，我们证明在表达 OsPIN2 的植物中，游离 IAA 分布在根、芽中，尤其是在根-芽连接处发生了变化。我们还在 OsPIN2 过表达植物中检测了 OsTAC1 、 OsPIN1b 和 OsLazy1 的表达模式。结果表明，OsPIN2 可用于分子育种以改进水稻结构。

结果

OsPIN2 对 PIN2 系列成员进行编码

OsPIN2 被提议作为生长素外排转运蛋白和 PIN 家族的成员 （Wang et al.， 2009）。OsPIN2 （AK101191） 的 cDNA 序列包含 2276 个核苷酸和 cDNA 之间的比对，基因组序列显示该基因有 7 个外显子和 6 个内含子（图 S1A）。ORF 编码 629 个氨基酸残基的蛋白质，与拟南芥 AtPIN2 显示 56.3% 的序列同一性（图 S2）。氨基酸序列的水疗法和跨膜 （TM） 基序分析显示，OsPIN2 蛋白包含三个特征区，包括一个具有五个 TM 结构域的疏水区，一个主要亲水的核心，然后是另一个具有四个 TM 段的疏水区（图 S1B）。

显示 OsPIN2 过表达和转化体表型的转基因水稻的生成

泛素启动子 （pUbi） 长期以来一直被报道为基因转移研究中各种应用中有用的强启动子，并在快速分裂的细胞中最积极地驱动基因表达 （Cornejo et al.， 1993）。为了研究 OsPIN2 在水稻中的功能，我们制作了过表达由 pUbi 驱动的全长 cDNA 的转基因水稻植物。Southern blotting 分析显示，它们来自两个彼此不同的转基因系 （分别为 O1 和 O 2 ），并且都具有一个转基因拷贝（图 1a）。实时 RT-PCR 分析显示，OsPIN2 的转录表达在根-芽连接和根中适中，但在 WT 的叶子中非常微弱（未转化的植物作为对照）（图 1b）。在这两个转基因品系中，OsPIN2 在根-芽连接处具有最丰富的转录本，在叶和根中具有相似的水平（图 1b）。在这些组织中，由 pUbi 驱动的 OsPIN2 转录表达增加 3-15 倍。

与 WT 相比，OsPIN2 的过表达显着增加了分蘖角和数量，并降低了水稻的高度（图 1i）。在发芽后 80 天（图 1c-j），O1 和 O2 植株的分蘖角（左侧和右侧最外侧分蘖之间的角度）（分别为 44 和 48）比 WT （22） 宽（图 1c）。此外，两个转基因品系每株植物的分蘖数（分别为 21 个和 23 个）比 WT（平均 17 个）多得多（图 1d）。相比之下，OsPIN2 过表达使整个株高非常显着（图 1e）。转基因植物表型可遗传自 T₀（图 2f-h）到 T₂世代（图 2i-j）。
与 WT 相比，OsPIN2 的过表达显着增加了分蘖角和数量，并降低了水稻的高度（图 1i）。在发芽后 80 天（图 1c-j），O1 和 O2 植株的分蘖角（左侧和右侧最外侧分蘖之间的角度）（分别为 44 和 48）比 WT （22） 宽（图 1c）。此外，两个转基因品系每株植物的分蘖数（分别为 21 个和 23 个）比 WT（平均 17 个）多得多（图 1d）。相比之下，OsPIN2 过表达使整个株高非常显着（图 1e）。转基因植物表型可从 T₀ （图 2f-h） 遗传到 T₂ 代 （图 2i-j）。

在成熟阶段（图 1j），与对照相比，OsPIN2 过表达植物表现出更短的穗长、更少的每穗粒数和更低的每穗粒重（表 1）。尽管 O1、O2 和 WT 之间的结实率相似，但 O1 植物的有效分蘖数增加了 35%，导致相对于对照植物，每株植物的谷物产量增加了 16%（表 1）。O2 植物表现出相同的趋势，但穗数和产量没有显着增加（表 1）。OsPIN2 过表达也使籽粒长度和宽度分别降低了 4%–7% 和 12%–16%（表 1）。与 WT 相比，粒度的变化导致 1000 粒重量减少了 10%–12.5%。此外，OsPIN2 的过表达显着减少了不定根的数量和总根长 22%-28%（表 2）。

为了确认 O1 和 O2 表型的变化是由于转基因植物中 OsPIN2 的过表达引起的，我们检测了这两个细胞系中一个拷贝 T-DNA 插入的位置。含有 ubi 启动子的 T-DNA 分别插入 O1 和 O2 基因组的 3 号和 10 号染色体中（图 2）。插入位点没有 O1 和 O2 的推定基因。这一直接遗传证据进一步支持 OsPIN2 对图 1 中转基因水稻改变表型的贡献。

OsPIN2 过表达改变水稻生长素转运

为了评估 OsPIN2 的过表达是否影响游离生长素水平，采用高效液相色谱 （HPLC） 定量转基因和 WT 植株各器官中内源性游离 IAA 的浓度。在从上往下的第一片和第二片叶子中，O1 和 O2 转基因植株的游离 IAA 浓度比对照植株低 11%-35%（图 3a）。在第一片叶子的鞘中，转基因植株和 WT 的游离 IAA 浓度几乎相同，而在第二片叶的鞘中，O1 和 O2 植株的游离 IAA 浓度比 WT 低 38%–53%（图 3b）。相比之下，在根-芽连接处（芽基部）中，两个转基因品系的游离 IAA 含量比 WT 高 65%-128%（图 3c）。

为了检测 OsPIN2 过表达对生长素分布的影响，我们将单个根分为三个部分：0-4 cm，包括根尖和伸长区;4-8 cm，侧根区;和 8-12 厘米，靠近根芽连接处。转基因根和 WT 根都显示出相同的游离 IAA 浓度模式，但从尖端到根基突然降低（图 3d）。但是，

OsPIN2 的过表达导致每个根段中游离 IAA 浓度增加数倍（图 3d）。

DR5：：GUS 进一步可视化了 IAA 分布，DR5：：GUS 是一种特定的报告基因，包含高度活性合成生长素反应元件的 7 次重复，可以反映体内生长素水平（Ulmasov et al.， 1997）（图 4）。GUS 染色显示，与对照相比，DR5 ： GUS 在 O 1 和 O 2 植物中的表达在叶尖受到强烈抑制（图 4A、F、K）。O1、O2 和对照植物的叶片和鞘中的 GUS 丰度相似（图 4A-O）。在根芽连接处，DR5：：GUS 表达似乎集中在对照植物的韧皮部细胞中（图 4a），而它显示出非组织特异性模式，即在 O1 和 O2 系的所有细胞类型中表达（图 4b，c）。

此外，IAA 分布在根中也发生了变化（图 4d-l）。在根尖，DR5：：GUS 在对照根尖分生组织中极化;然而，在 O 1 和 O 2 系中，GUS 表达从顶端分生组织到伸长区缺乏极性（图 4d，g，j）。此外，O1 和 O 2 中侧根中的 GUS 染色比对照植物强得多（图 4e，h，k）。DR5：：GUS 表达模式匹配并支持从不同器官中游离 IAA 水平的定量中观察到的分布（图 3）。OsPIN2 参与极性生长素转运

为了验证 OsPIN2 是否参与极性生长素运输，在根-芽连接处用 20 l M NPA 处理 WT 、 O1 和 O2 的 21 日龄幼苗 。在 WT 中，目标

表1 盆栽试验野生型（WT）和OsPIN2转基因幼苗农艺性状及产量统计

数字以 SE ±平均值表示。每个平均值的观测值数为 5，除了从 10 棵幼苗中记录的粒长、粒宽、1000 粒重和每株产量。同一列中的平均值后跟同一字母没有显著差异（P < 0.05，LSD 检验）。

NPA 的施用显著增加了总根的长度，尤其是侧根，但降低了不定根数和侧根密度，而在两种转基因植株中，NPA 处理对总根长和总数没有显著影响，除了侧根的长度也大幅增加（表 2）。

NPA 对 O1 、 O 2 和 WT 生长素转运的不同影响可以通过根中不同的 DR5：：GUS 活性来可视化（图 5）。在 WT 中，当 NPA 施加在根芽连接处时，GUS 活性仅限于根尖（图 5a、d）。然而，NPA 处理对 O1 和 O2 植物根系的 GUS 活性和分布影响不大（图 5b、c、e、f）。

分蘖角相关基因和 OsPIN1b 在过表达 OsPIN2 的植株中的表达

OsLazy1 被认为是极性生长素转运的负调节因子，在调节水稻芽引力方面起重要作用，进而影响分蘖角 （Li et al.， 2007）。水稻中 Lazy1 基因的突变显示出与 O1 和 O2 植物相似的表型，分蘖数量和角度增加。在这项研究中，我们检测到 OsLazy1 的转录在 O1 和 O2 植物的叶片以及 O1 植物的根中都受到非常大的抑制

（图 6a）。

据报道，TAC1 （分蘖角控制器 1） 对于控制水稻植物结构的分蘖角调节至关重要 （Yu et al.， 2007）。OsTAC1 的突变导致紧凑的植物结构，分蘖角接近于零（Yu等人，2007）。然而，OsTAC1 在较大分蘖角植物的根和叶中的表达没有改变（在 O1 植物中）和降低（在 O2 植物中）

距根尖 8-12 cm（右）。

与其在对照中的表达进行比较（图 6b）。这一结果表明，OsPIN2 过表达改变水稻的结构不是通过 OsTAC1 调节途径发生的，至少在 OsTAC1 转录水平上没有。

在水稻中 12 种推定的生长素外排转运蛋白中，OsPIN1b 是唯一一种在植物中具有已知作用的转运蛋白（Xu et al.， 2005）。RNAi 抑制 OsPIN1b 导致分蘖数量和角度显着增加，而其由 35S 启动子驱动的过表达对分蘖数量没有显示出任何显着影响（Xu等人，2005）。有趣的是，通过过表达 OsPIN2 在水稻根和芽中都没有发生 OsPIN1b 表达的显着改变（图 6c），表明 PIN1b 和 PIN2 存在不同的辅助独立性调节途径参与控制水稻冠层结构（图 6c）。

讨论

水稻冠层结构包括株高、分蘖数和角度以及穗形态是影响籽粒产量的关键性状（Jiao et al.， 2010）。由 AUX1、PIN 和 p-糖蛋白 ABC 转运蛋白介导的生长素分布（Bennett et al.， 1996;Friml 等人，2003 年;Blilou et al.， 2005）长期以来一直被认为可以改变植物结构。PINs 的一般功能是将生长素运输出细胞并控制生长素调节的生长过程（Petra'sek et al.， 2006）。在水稻基因组中，已经鉴定出 12 个 PIN 家族成员 （Wang et al.， 2009），但其中只有一个 （OsPIN1b） 进行了功能表征 （Xu et al.， 2005）。通过在水稻中通过转基因方法过表达 OsPIN2，我们表明 OsPIN2 在控制冠层结构中起重要作用（图 1 和表 2）。定量

根尖。

通过 HPLC 测量 IAA 浓度并使用 DR5：：GUS 报告基因活性进行可见光检测表明，OsPIN2 影响各个器官中的游离生长素分布。根-芽连接处的局部外部 NPA 应用对 OsPIN2 过表达植物的根生长影响很小（图 5），这表明 OsPIN2 直接影响极性生长素运输。此外，转录分析表明，OsPIN2 在水稻中调节 OsLazy1，但不调节 OsTAC1 和 OsPIN1b，这表明 OsPIN2 与 OsPIN1b 和 OsTAC1 一起在生长素调节的叶冠生长中具有独特的作用。

OsPIN2 在水稻植株中的功能获得

先前报道，敲低 OsPIN1b 表达非常显着地增加了分蘖的数量和分蘖角，而过表达并没有改变水稻的芽结构（Xu et al.， 2005）。在水稻基因组中，OsLazy1 已被鉴定为一种新的草特异性蛋白，在极性生长素转运中起负作用;它的突变导致水稻分蘖角的增加（Abe et al.， 1996;Li et al.， 2007;Yoshihara 和 Iino，2007 年）。有趣的是，推测增强 OsLazy1 表达是否可以进一步压缩水稻结构。此外，OsTAC1 被定义为水稻中的分蘖角对照基因，其表达水平与分蘖角和数量呈正相关 （Yu et al.， 2007）。
先前报道，OsPIN1b 表达的敲低非常显着地增加了分蘖的数量和分蘖角，而过表达并没有改变水稻的芽结构（Xu et al.， 2005）。在水稻基因组中，OsLazy1 已被鉴定为一种新的草特异性蛋白，在极性生长素转运中起负作用;它的突变导致水稻分蘖角的增加（Abe et al.， 1996;Li et al.， 2007;Yoshihara 和 Iino，2007 年）。有趣的是，推测增强 OsLazy1 表达是否可以进一步压缩水稻结构。此外，OsTAC1 被定义为水稻中的分蘖角对照基因，其表达水平与分蘖角和数量呈正相关 （Yu et al.， 2007）。

过表达 OsPIN2 的转基因植物比 WT 显示出更大的分蘖角、更低的植物高度、更多的分蘖（图 2c-e），这与 OsPIN1b 敲低突变体相似（Xu等人，2005）。OsPIN2 和 OsPIN1b 表达改变引起的表型变化支持水稻株高与分蘖数呈负相关的普遍观察结果（Wang 和 Li，2005）。因此，生长素可能在植物高度和分枝之间的串扰中起关键作用，这是人们对冠层结构知之甚少的一个方面。
过表达 OsPIN2 的转基因植物比 WT 显示出更大的分蘖角、更低的植物高度、更多的分蘖（图 2c-e），这与 OsPIN1b 敲低突变体相似（Xu 等人，2005）。OsPIN2 和 OsPIN1b 表达改变引起的表型变化支持水稻株高与分蘖数呈负相关的普遍观察结果（Wang 和 Li，2005）。因此，生长素可能在植物高度和分枝之间的串扰中起关键作用，这是人们对冠层结构知之甚少的一个方面。

图 5 GUS 在野生型 （a， d）、O1 （b， e） 和 O2 （c， f） 幼苗中表达，无论是否经过 NPA 处理。根尖的 GUS 活性染色 2 小时。Bar = 100 升米 （a–c） 在 IRRI 营养溶液中生长的 21 日龄幼苗的根尖。（d-f） 21 日龄幼苗的根尖在芽基部用 20 lM NPA 处理 7 天。
图 5 携带 DR5：：GUS 的野生型 （a， d）、O1 （b， e） 和 O2 （c， f） 幼苗根尖中的 GUS 表达，无论是否经过 NPA 处理。根尖的 GUS 活性染色 2 小时。Bar = 100 m. （a–c） 在 IRRI 营养溶液中生长的 21 日龄幼苗的根尖。（d-f） 21 日龄幼苗的根尖在芽基部 20 M NPA 处理 7 天。

过表达 OsPIN2 也导致不定根减少（表 2），这与 OsPIN1b 敲低突变体相似（Xu等人，2005 年）。NPA 是一种特征明确的极性生长素转运抑制剂，它强烈抑制生长素外流 （Luschnig， 2001）。在根-芽连接处阻断极性生长素转运会抑制侧根起始（Reed等人，1998）。周 et al. （2003） 报道，在水稻根-芽连接处施用NPA阻止了水稻不定根和侧根的起始和生长，与我们在本研究中观察到的WT相同（表2）。然而，我们发现局部 NPA 处理对 OsPIN2 过表达系的根生长影响很小（表 2）。这表明高水平的 OsPIN2 表达部分克服了 NPA 处理对不定根形成的抑制作用，并改变了对 NPA 的敏感性。
过表达 OsPIN2 也导致不定根减少（表 2），这与 OsPIN1b 敲低突变体相似（Xu 等人，2005 年）。NPA 是一种特征明确的极性生长素转运抑制剂，它强烈抑制生长素外流 （Luschnig， 2001）。在根-芽连接处阻断极性生长素转运会抑制侧根起始（Reed 等人，1998）。周 et al. （2003） 报道，在水稻根-芽连接处施用 NPA 阻止了水稻不定根和侧根的起始和生长，与我们在本研究中观察到的 WT 相同（表 2）。然而，我们发现局部 NPA 处理对 OsPIN2 过表达系的根生长影响很小（表 2）。这表明高水平的 OsPIN2 表达部分克服了 NPA 处理对不定根形成的抑制作用，并改变了对 NPA 的敏感性。

在拟南芥中，已经表明 AtPIN1 和 AtPIN2 是 PIN 家族成员的不同代表，当在同一细胞中表达并定位于细胞的同一侧时，可以在植物中功能上相互替换（Wis'niewska等人，2006 年;Zhang et al.， 2010）。尽管水稻基因组中至少有 12 个 PIN 家族成员（Wang等人，2009 年），但我们的结果显示 OsPIN2 的表达水平与分蘖角和数量相关（图 1）。虽然 OsPIN1b 的大量表达对于保持水稻结构紧凑是必要的 （Xu et al.， 2005），但 OsPIN2 和 OsPIN1b 在水稻结构的控制中显示出相反的作用。
在拟南芥中，已经表明 AtPIN1 和 AtPIN2 是 PIN 家族成员的不同代表，当在同一细胞中表达并定位于细胞的同一侧时，可以在植物中功能上相互替换（Wis'niewska 等人，2006 年;Zhang et al.， 2010）。尽管水稻基因组中至少有 12 个 PIN 家族成员（Wang 等人，2009 年），但我们的结果显示 OsPIN2 的表达水平与分蘖角和数量相关（图 1）。虽然 OsPIN1b 的大量表达对于保持水稻结构紧凑是必要的 （Xu et al.， 2005），但 OsPIN2 和 OsPIN1b 在水稻结构的控制中显示出相反的作用。

因此，水稻的分蘖角度控制光合效率和种植密度决定了最终产量（Fu 和 Zuo，2007）。在我们的盆栽实验中，对 O1 和 O2 植物的蔓延生长没有空间限制，转基因植物的产量高于 WT（表 1）。在我们的田野绘图跟踪 （1.3 · 1.3 m），种植密度从59 （15 · 15 厘米）到 46 （15 · 20 厘米）植物 ⁄ m²（表 S4）。在田间，极端撒布和紧凑稻类型实际上都对粮食生产没有好处（Wang 和 Li，2008）。OsPIN2 的遗传作具有调节农艺价值性状的潜力。
因此，水稻的分蘖角度控制光合效率和种植密度决定了最终产量（Fu 和 Zuo，2007）。在我们的盆栽实验中，对 O1 和 O2 植物的蔓延生长没有空间限制，转基因植物的产量高于 WT（表 1）。在我们的田野绘图跟踪 （1.3 · 1.3 m），种植密度从 59 （15 · 15 厘米）到 46 （15 · 20 cm） 植物 ⁄ m² （表 S4）。在田间， 极端撒布和紧凑稻类型实际上都对粮食生产没有好处（Wang 和 Li，2008）。OsPIN2 的遗传作具有调节农艺价值性状的潜力。

OsPIN2 过表达改变了生长素的分布
OsPIN2 过表达改变了生长素的分布

吲哚-3-乙酸以游离和共轭形式存在，分别对应于生物活性激素和储存激素。局部游离 IAA 具有生物活性，有助于植物生长和发育的调节（Ljung et al.， 2002;Bajguz 和 Piotrowska，2009 年）。我们测量了游离 IAA 水平，以确定我们观察到的表型是否是由游离 IAA （活动性 IAA） 的分布引起的。在高等植物中，游离 IAA 浓度通常非常低，通常在纳摩尔范围内（Woodward 和 Bartel，2005）。在 12 日龄的拟南芥整苗中，游离 IAA 水平约为 80 ng ⁄ g（Sun et al.， 2010）。Kai 等人（2007 年）在 2 周龄的水稻幼苗中发现，游离 IAA 水平约为 35 ng ⁄ g，与根相比，地上部分的游离 IAA 水平更高。在这项研究中，我们检查了 60 日龄幼苗的八个部分，以了解游离 IAA 的分布模式。不同组织中的游离 IAA 水平在 100-4000 lg ⁄ g 的范围内变化（图 3a-d）。在地上部分，OsPIN2 过表达幼苗中的游离 IAA 水平远低于 WT （图 3a、b），而转基因幼苗和 WT 之间的差异相反，根和根-芽连接处更高（图 3c、d）。
吲哚-3-乙酸以游离和共轭形式存在，分别对应于生物活性激素和储存激素。局部游离 IAA 具有生物活性，有助于植物生长和发育的调节（Ljung et al.， 2002;Bajguz 和 Piotrowska，2009 年）。我们测量了游离 IAA 水平，以确定我们观察到的表型是否是由游离 IAA （活动性 IAA） 的分布引起的。在高等植物中，游离 IAA 浓度通常非常低，通常在纳摩尔范围内（Woodward 和 Bartel，2005）。在 12 日龄的拟南芥整苗中，游离 IAA 水平约为 80 ng ⁄ g（Sun et al.， 2010）。Kai 等人（2007 年）在 2 周龄的水稻幼苗中发现，游离 IAA 水平约为 35 ng ⁄ g，与根相比，地上部分的游离 IAA 水平更高。在这项研究中，我们检查了 60 日龄幼苗的八个部分，以了解游离 IAA 的分布模式。不同组织中的游离 IAA 水平在 100-4000 lg g 的范围内变化 （图 3a-d）。在地上部分，OsPIN2 过表达幼苗中的游离 IAA 水平远低于 WT （图 3a、b），而转基因幼苗和 WT 之间的差异相反，根和根-芽连接处更高（图 3c、d）。

在拟南芥中，AtPIN2 定位于皮质细胞的基底侧以及表皮和根帽细胞的顶端（面向芽）侧，它主要调节根基底生长素运输（Feraru 和 Friml，2008）。WT 和转基因植物之间的芽、根和根-芽连接处的反向 IAA 分布模式可能是由 OsPIN2 的极性亚细胞定位受干扰引起的。我们的结果表明，WT 或 OsPIN2 过表达植株中游离 IAA 的含量从根的顶端到基部下降。在根的尖端和中段，转基因植株的游离 IAA 比 WT 高几倍（图 3），证实在水稻根系中，OsPIN2 过表达也增强了基部生长素的运输。
在拟南芥中，AtPIN2 定位于皮质细胞的基底侧以及表皮和根帽细胞的顶端（面向芽）侧，它主要调节根基底生长素运输（Feraru 和 Friml，2008）。WT 和转基因植物之间的芽、根和根-芽连接处的反向 IAA 分布模式可能是由 OsPIN2 的极性亚细胞定位受干扰引起的。我们的结果表明，WT 或 OsPIN2 过表达植株中游离 IAA 的含量从根的顶端到基部下降。在根的尖端和中段，转基因植株的游离 IAA 比 WT 高几倍（图 3），证实在水稻根系中，OsPIN2 过表达也增强了基部生长素的运输。

水稻 lazy1 突变体通过大大增强极性生长素转运表现出分蘖传播表型，从而改变了芽中内源性 IAA 分布（Li et al.， 2007）。在具有 DR5：：GUS 的 lazy1 突变体中，GUS 表达已向下移动到突变体胚芽鞘的基部，表明突变植物中内源性 IAA 分布的改变有助于分蘖的扩散生长（Li等人，2007 年）。在表达 OsPIN2 的植物中，在叶尖、根芽连接处和根的三个不同部分可以看到不同的 GUS 染色模式（图 4）。DR5：：GUS 染色的观察结果与根-芽连接处和根中测得的游离 IAA 水平一致。在根芽连接处，与对照相比，转基因植物显示出更广泛的 GUS 染色，没有细胞特异性（图 4a-c），而在根尖，相对于对照植物，伸长区有更明显的 GUS 染色（图 4d，g，j）。

tively.值以平均值±标准差 （n = 3） 显示。
tively.值以平均值±标准差 （n = 3） 显示。

在芽中，除了尖端区域外，GUS 染色（图 4B-O）与游离 IAA 的测量值不匹配（图 3a、b）。这种差异可能是由一个事实引起的，即在 GUS 染色之前必须将水稻叶切成小块，因为富含硅的坚硬壁和角质层会阻止基质进入叶细胞。与未缠绕区域相比，叶子的受伤边缘允许更多的底物进入细胞进行 GUS 反应（图 4B-O）。
在芽中，除了尖端区域外，GUS 染色（图 4B-O）与游离 IAA 的测量值不匹配（图 3a、b）。这种差异可能是由一个事实引起的，即在 GUS 染色之前必须将水稻叶切成小块，因为富含硅的坚硬壁和角质层会阻止基质进入叶细胞。与未缠绕区域相比，叶子的受伤边缘允许更多的底物进入细胞进行 GUS 反应（图 4B-O）。

O1 和 O2 中的 GUS 表达谱表明，增强的基瓣极性生长素转运是 OsPIN2 过表达植物中内源性 IAA 分布变化的主要原因。从不同器官中 DR5 活性和游离 IAA 浓度的变化，我们得出结论，OsPIN2 过表达的结构改变是由生长素再分布引起的，尤其是在根芽连接处。
O1 和 O2 中的 GUS 表达谱表明，增强的基瓣极性生长素转运是 OsPIN2 过表达植物中内源性 IAA 分布变化的主要原因。从不同器官中 DR5 活性和游离 IAA 浓度的变化，我们得出结论，OsPIN2 过表达的结构改变是由生长素再分布引起的，尤其是在根芽连接处。

在过表达 OsPIN2 的植物中，生长素转运通过抑制 OsLazy1 来增加分蘖角
在过表达 OsPIN2 的植物中，生长素转运通过抑制 OsLazy1 来增加分蘖角

分蘖角是一个重要的农艺性状，有助于水稻冠层的结构（Xu et al.， 1998）。以前的生理研究表明，分蘖角受引力控制，而引力受生长素及其极性运输的调节（Abe et al.， 1996）。Atpin2 突变体表现出根伸长减少的无重力表型 （Mu ̈ ller et al.， 1998）。拟南芥浓密和矮小 1 （芽 1） 突变体缺乏极地生长素运输，它们表现出具有更多分支的改变结构，并且失去了顶端优势（Dai et al.， 2006）。最近的研究表明，拟南芥直立玫瑰花结 （URO） 突变体由于基瓣 IAA 运输减少而显示出浓密的植物结构（Prusinkiewicz等人，2009 年;Shimizu-Sato et al.， 2009;Sun et al.， 2010）。我们的 OsPIN2 过表达植物表明，在水稻中，增强的 IAA 转运到根芽连接处也导致分蘖角和数量增加。因此，在单子叶植物和双子叶植物中，生长素运输都是分蘖引力和结构所必需的。
分蘖角是一个重要的农艺性状，有助于水稻冠层的结构（Xu et al.， 1998）。以前的生理研究表明，分蘖角受引力控制，而引力受生长素及其极性运输的调节（Abe et al.， 1996）。Atpin2 突变体表现出根伸长减少的无重力表型 （Mu ̈ ller et al.， 1998）。拟南芥浓密和矮小 1 （芽 1） 突变体缺乏极地生长素运输，它们表现出具有更多分支的改变结构，并且失去了顶端优势（Dai et al.， 2006）。最近的研究表明，拟南芥直立玫瑰花结 （URO） 突变体由于基瓣 IAA 运输减少而显示出浓密的植物结构（Prusinkiewicz 等人，2009 年;Shimizu-Sato et al.， 2009;Sun et al.， 2010）。我们的 OsPIN2 过表达植物表明，在水稻中，增强的 IAA 转运到根芽连接处也导致分蘖角和数量增加。因此，在单子叶植物和双子叶植物中，生长素运输都是分蘖引力和结构所必需的。

在水稻中，OsPIN1 促进生长素转运 （Yu et al.， 2007），OsLazy1 抑制生长素转运 （Li et al.， 2007）。抑制 OsPIN1 表达导致更宽的分蘖角 （Yu et al.， 2007），而 OsLazy1 的突变导致相同的表型 （Li et al.， 2007）。生长素运输是否促进或抑制传播生长习性的问题以前没有得到解决。Yoshihara et al. （2007） 提出，水稻芽中存在两种信号通路，包括 LAZY1 依赖性和 -非依赖性重力反应，LAZY1 可能在调节生长素的横向易位过程中直接或间接地与 PIN 蛋白相互作用。当 OsPIN2 过表达时，OsLazy1 明显下调，而 OsTAC1 和 OsPIN1 表达变化不大（图 6）。结果表明，OsPIN2 过表达产生的分蘖角和数量增加是通过下调 OsLazy1 产生的，并且 OsPIN2 不与 OsPIN1 和 OsTAC1 相互作用。预测的 OsPIN2 和 OsLazy1 之间的相互作用使我们能够更深入地了解水稻冠层分枝的分子机制。
在水稻中，OsPIN1 促进生长素转运 （Yu et al.， 2007），OsLazy1 抑制生长素转运 （Li et al.， 2007）。抑制 OsPIN1 表达导致更宽的分蘖角 （Yu et al.， 2007），而 OsLazy1 的突变导致相同的表型 （Li et al.， 2007）。生长素运输是否促进或抑制传播生长习性的问题以前没有得到解决。Yoshihara et al. （2007） 提出，水稻芽中存在两种信号通路，包括 LAZY1 依赖性和 -非依赖性重力反应，LAZY1 可能在调节生长素的横向易位过程中直接或间接地与 PIN 蛋白相互作用。当 OsPIN2 过表达时，OsLazy1 明显下调，而 OsTAC1 和 OsPIN1 表达变化不大（图 6）。结果表明，OsPIN2 过表达产生的分蘖角和数量增加是通过下调 OsLazy1 产生的，并且 OsPIN2 不与 OsPIN1 和 OsTAC1 相互作用。预测的 OsPIN2 和 OsLazy1 之间的相互作用使我们能够更深入地了解水稻冠层分枝的分子机制。

除了 PIN 家族基因外，据报道许多 p-糖蛋白 ABC 转运蛋白催化细胞生长素外流，例如 AtABCB1 和 AtABCB19（Noh 等人，2001 年;Geisler 等人，2005 年;Nagashima et al.， 2008）。我们对 WT 、 O1 和 O2 根和叶中的其他 OsPINs 和水稻 AtABCB1 和 AtABCB19 直系同源基因进行了转录分析。然而，这些基因表达在转基因品系中几乎没有变化（图 S3 和 S4）。
除了 PIN 家族基因外，据报道许多 p-糖蛋白 ABC 转运蛋白催化细胞生长素外流，例如 AtABCB1 和 AtABCB19（Noh 等人，2001 年;Geisler 等人，2005 年;Nagashima et al.， 2008）。我们对 WT 、 O1 和 O2 根和叶中的其他 OsPINs 和水稻 AtABCB1 和 AtABCB19 直系同源基因进行了转录分析。然而，这些基因表达在转基因品系中几乎没有变化（图 S3 和 S4）。

总之，OsPIN2 是一种功能性生长素外排转运蛋白，参与水稻芽 LAZY1 依赖性重力反应。与 OsTAC1 和 OsPIN1 不同，转运蛋白在控制生长素依赖性冠层结构方面起着重要作用。OsPIN2 未来可直接用于改良冠层结构的水稻品种的分子育种。
总之，OsPIN2 是一种功能性生长素外排转运蛋白，参与水稻芽 LAZY1 依赖性重力反应。与 OsTAC1 和 OsPIN1 不同，转运蛋白在控制生长素依赖性冠层结构方面起着重要作用。OsPIN2 未来可直接用于改良冠层结构的水稻品种的分子育种。

实验程序
实验程序

向量的构建和水稻变换
向量的构建和水稻变换

从 Oryza sativa L. ssp. Japonica cv. 中扩增出全长 OsPIN2 基因的 1.8 kb cDNA 片段。Nipponbare cDNA，使用表 S1 中列出的引物。使用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 （TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd， Dalian， China） 扩增 OsPIN2 基因，两步 PCR 参数为 95 C 5 min，然后是 98 C 10 s，68 C 2 min （30 个循环） 和 72 C 10 min。BamHI 和 SpeI 限制性位点被添加到 5
从 Oryza sativa L. ssp. Japonica cv. 中扩增出全长 OsPIN2 基因的 1.8 kb cDNA 片段。Nipponbare cDNA，使用表 S1 中列出的引物。使用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 （TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd， Dalian， China） 扩增 OsPIN2 基因，两步 PCR 参数为 95 C 5 min，然后是 98 C 10 s，68 C 2 min （30 个循环） 和 72 C 10 min。BamHI 和 SpeI 限制性位点被添加到 5¢ 分别是正向和反向引物的末端，以促进克隆到表达载体 p1390-Ubi 中（Chen等人，2004）。构建的质粒命名为 pUbi：：OsPIN2 并通过测序确认。然后使用根癌农杆菌（菌株 EHA105）转化该构建体，如 Upadhyaya 等人 （2000） 所述。50 毫克后
分别是正向和反向引物的末端，以促进克隆到表达载体 p1390-Ubi 中（Chen 等人，2004）。构建的质粒命名为 pUbi：：OsPIN2 并通过测序确认。然后使用根癌农杆菌（菌株 EHA105）转化该构建体，如 Upadhyaya 等人 （2000） 所述。50 毫克后⁄L 潮霉素（Roche，http://www.roche.com/index.htm）筛选，T
L 潮霉素（Roche，http：//www.roche.com/index.htm）筛选，T
L 潮霉素（Roche，http://www.roche.com/index.htm）筛选，T₀种植世代转基因植物作为种子。在 T 中测试 T-DNA 插入数
种植世代转基因植物作为种子。在 T 中测试 T-DNA 插入数₁实时生成转基因植物
实时生成转基因植物定量 PCR（Bubner 和 Baldwin，2004 年;Yang et al.， 2005） 和两个低拷贝数系 （O8-4， O20-1） 从五个阳性线中选择，分别命名为 O1 和 O 2 （表 S2）。此外，通过 Southern 印迹（DIG High Prime DNA 标记和检测入门试剂盒 I;罗氏公司）。用地高辛标记的 Hyg 基因编码序列的片段用作探针，根据供应商的说明 （Roche） 通过 PCR 制备。热不对称交错 （尾部） PCR （Genome Walking Kit;http://www.takara.com.cn） 检测 O1 和 O2 系的 T-DNA 插入位点。
定量 PCR（Bubner 和 Baldwin，2004 年;Yang et al.， 2005） 和两个低拷贝数系 （O8-4， O20-1） 从五个阳性线中选择，分别命名为 O1 和 O 2 （表 S2）。此外，通过 Southern 印迹（DIG High Prime DNA 标记和检测入门试剂盒 I;罗氏公司）。用地高辛标记的 Hyg 基因编码序列的片段用作探针，根据供应商的说明 （Roche） 通过 PCR 制备。热不对称交错 （尾部） PCR （Genome Walking Kit;http://www.takara.com.cn） 检测 O1 和 O2 系的 T-DNA 插入位点。

为了检测 WT、O1 和 O2 植物的 IAA 分布模式，将 pDR5：：GUS 构建体转化为 WT 和 T₂使用根癌农杆菌 （菌株 EHA105） 生成 O 1 和 O 2 植物进行 GUS 染色。pDR5：：GUS 构建体由浙江大学 Ping Wu 教授小组友情提供。
为了检测 WT 、 O1 和 O2 植物的 IAA 分布模式，将 pDR5：：GUS 构建体转化到 WT 中， 并使用根癌农杆菌 （菌株 EHA105） 对 O1 和 O2 植物的 T 2 代进行 GUS 染色。pDR5：：GUS 构建体由浙江大学 Ping Wu 教授小组友情提供。

植物材料、生长条件、NPA 处理和结构参数测量
植物材料、生长条件、NPA 处理和结构参数测量

种子灭菌程序如前所述（Chang et al.， 2009）。含有 IRRI 营养液
种子灭菌程序如前所述（Chang et al.， 2009）。含有 IRRI 营养液

1.25米 NH₄不₃， 0.3米 KH₂采购订单₄， 0.35 米M K₂所以₄、1 mM 氯化钙₂， 1 mM 硫酸镁₄， 0.5 mM 钠₂氧化硅₃、20 升M EDTA-Fe、9 升M MnCl₂， 20 升M H₃博₃， 0.77 升M ZnSO₄、0.32 升M CuSO₄和 0.39 升M （NH₄)₆莫₇O₂₄。调节溶液 pH 值至 5.5，每 2 天更换一次溶液。将发芽的水稻种子种植在水培培养物中，第一周含有半浓度的营养液，之后含有完整的营养液。植物在 26-32 C 的 14 小时光照和 18-22 C 的黑暗 10 小时的温室中生长。为了测定根和芽中的基因表达和内源游离 IAA，WT 、 O1 和 O2 幼苗在 IRRI 溶液中生长 60 d;使用 WT 、 O1 和 O2 的 21 日龄幼苗分析极性生长素转运抑制剂 NPA 对植物生长的影响。通过直接从移液管中将含有 20 lM NPA 的稀释琼脂分配到根-芽连接处，进行 NPA 的局部应用。在这项研究中，未转化的对照被用作 WT。所有实验均使用 5 次重复。

使用基于扫描仪的图像分析系统 WinRhizo （Regent Instruments， Montreal， QC， Canada） 测量不定根的总根长和侧根数。如 Jin 等人 （2008） 所述，在左侧最外侧的蘖子和右侧最外侧的蘖子之间测量分蘖角。
使用基于扫描仪的图像分析系统 WinRhizo （Regent Instruments， Montreal， QC， Canada） 测量不定根的总根长和侧根数。如 Jin 等人 （2008） 所述，在左侧最外侧的蘖子和右侧最外侧的蘖子之间测量分蘖角。

半定量 RT-PCR 分析
半定量 RT-PCR 分析

使用 TRIzol 试剂 （Invitrogen， http://www.invitrogen.com） 分离根和叶的总 RNA。第一链 cDNA 是用寡核苷酸 （dT）-18 引物和逆转录酶 （Fermentas， Hanover， MD） 合成的。使用表 S3 中所示的基因特异性引物进行 RT-PCR。检测 OsActin、OsLazy1、OsTAC1、OsPINs、OsAUX1、OsABCB1 和 OsABCB19 的 PCR 参数分别为 95 C 5 分钟，然后是 25、35、33、30-40、28、30 和 30 个循环，分别为 94 C 30 秒、55 C 30 秒、72 C 30 秒和 72 C 5 分钟。
使用 TRIzol 试剂 （Invitrogen， http://www.invitrogen.com） 分离根和叶的总 RNA。第一链 cDNA 是用寡核苷酸 （dT）-18 引物和逆转录酶 （Fermentas， Hanover， MD） 合成的。使用表 S3 中所示的基因特异性引物进行 RT-PCR。检测 OsActin、OsLazy1、OsTAC1、OsPINs、OsAUX1、OsABCB1 和 OsABCB19 的 PCR 参数分别为 95 C 5 分钟，然后是 25、35、33、30-40、28、30-40、28、30 和 30 个循环，分别为 94 C 30 秒、55 C 30 秒、72 C 30 秒和 72 C 5 分钟。

实时定量 PCR 分析
实时定量 PCR 分析

使用 MyiQ 单色实时 PCR 系统 （Bio-Rad， Hercules， CA） 和 SYBR Premix Ex Taq （Takara） 进行定量 PCR。每个反应物含有 1 L第一链 cDNA 作为模板，总体积为 20 L反应混合物。OsPIN2 的引物组为：5¢-CAACACCTACTCCAGCCTC-3¢ 和 5¢-TGGACCAGTCAAGAACCTC-3¢;OsActin 的引物组为：5¢-TTATGGTTGGGATGGGACA-3¢ 和 5¢-AGCACGGCTTGAATAGCG-3¢分别。确定所有基因的模板 RNA 的量和提供线性基因扩增范围的循环数 （Chen et al.， 2007）。OsPIN2 的相对表达水平显示为 OsPIN2 拷贝数与 OsActin 拷贝数的百分比。
使用 MyiQ 单色实时 PCR 系统 （Bio-Rad， Hercules， CA） 和 SYBR Premix Ex Taq （Takara） 进行定量 PCR。每个反应物含有 1 L 第一链 cDNA 作为模板，总体积为 20 L 反应混合物。OsPIN2 的引物组为：5¢-CAACACCTACTCCAGCCTC-3¢ 和 5¢-TGGACCAGTCAAGAACCTC-3¢;OsActin 的引物组分别为：5¢-TTATGGTTGGGATGGGACA-3¢ 和 5¢-AGCACGGCTTGAATAGCG-3¢。确定所有基因的模板 RNA 的量和提供线性基因扩增范围的循环数 （Chen et al.， 2007）。OsPIN2 的相对表达水平显示为 OsPIN2 拷贝数与 OsActin 拷贝数的百分比。

内源性 IAA 的定量
内源性 IAA 的定量

从芽顶开始的第一和第二片叶子及其鞘在叶片节处分离。将整个根切成三部分：从每个根尖开始 0-4 厘米、4-8 厘米和 8-12 厘米。此外，从每个分蘖中取出 0.5 cm 根-芽连接进行分析。称取样品，得到新鲜重量，并立即投入液氮中。根据 Lu 等人 （2008） 描述的方法进行样品制备和用 HPLC 测量游离 IAA。标准 IAA 样品从 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。
从芽顶开始的第一和第二片叶子及其鞘在叶片节处分离。将整个根切成三部分：从每个根尖开始 0-4 厘米、4-8 厘米和 8-12 厘米。此外，从每个分蘖中取出 0.5 cm 根-芽连接进行分析。称取样品，得到新鲜重量，并立即投入液氮中。根据 Lu 等人 （2008） 描述的方法进行样品制备和用 HPLC 测量游离 IAA。标准 IAA 样品从 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。

GUS 染色
GUS 染色

与用于 IAA 定量分析的相同样品用于组织化学 GUS 染色（Ai等人，2009 年）。观察前用乙醇处理绿色组织以去除叶绿素色素沉着。使用奥林巴斯 MVX10 立体显微镜和彩色 CCD 相机（奥林巴斯，http://www.olympus-global.com 年）对染色组织进行拍照。
与用于 IAA 定量分析的相同样品用于组织化学 GUS 染色（Ai 等人，2009 年）。观察前用乙醇处理绿色组织以去除叶绿素色素沉着。使用奥林巴斯 MVX10 立体显微镜和彩色 CCD 相机（奥林巴斯，http://www.olympus-global.com 年）对染色组织进行拍照。

确认
确认

该研究由国家基础研究计划973（2011CB100302）、国家自然科学基金（30971854、31071846）、江苏省自然科学基金（BK2010440）、江苏省高等学校青蓝项目优先学术计划发展和转基因项目（2008ZX08001-0052、2009ZX08009-126B）资助。来自英国诺里奇研究园 John Innes 中心的 Tony Miller 博士仔细地更正了手稿。
该研究由国家基础研究计划 973（2011CB100302）、国家自然科学基金（30971854、31071846）、江苏省自然科学基金（BK2010440）、江苏省高等学校青蓝项目优先学术计划发展和转基因项目（2008ZX08001-0052、2009ZX08009-126B）资助。来自英国诺里奇研究园 John Innes 中心的 Tony Miller 博士仔细地更正了手稿。

引用
引用

Abe， K.， Takahashi， H. 和 Suge， H. （1996） 懒惰基因 （la） 负责水稻幼苗的不重力性和分蘖生长的懒惰习性 （Oryza sativa L）。J. 普兰特。第 109 号决议，第 381-386 页。
Abe， K.， Takahashi， H. 和 Suge， H. （1996） 懒惰基因 （la） 负责水稻幼苗的不重力性和分蘖生长的懒惰习性 （Oryza sativa L）。J. 普兰特。第 109 号决议，第 381-386 页。

Ai， P.H.， Sun， S.B.， Zhao， J.N.， Fan， X.R.， Xin， W.J.， Guo， Q.， Yu， L.， Shen， Q.R.， Wu， P.， Miller， AJ and Xu， G.H. （2009） 两种水稻磷酸盐转运蛋白，OsPht1;2 和 OsPht1;6、在摄取和转位方面具有不同的功能和动力学特性。植物 J. 57， 798–809。
Ai， P.H.， Sun， S.B.， Zhao， J.N.， Fan， X.R.， Xin， W.J.， Guo， Q.， Yu， L.， Shen， Q.R.， Wu， P.， Miller， AJ and Xu， G.H. （2009） 两种水稻磷酸盐转运蛋白，OsPht1;2 和 OsPht1;6、在摄取和转位方面具有不同的功能和动力学特性。植物 J. 57， 798–809。

Bajguz， A. 和 Piotrowska， A. （2009） 生长素和细胞分裂素的偶联物。
Bajguz， A. 和 Piotrowska， A. （2009） 生长素和细胞分裂素的偶联物。

植物化学， 70， 957–969。
植物化学， 70， 957–969。

Bennett， MJ， Marchant， A.， Green， H.G.， May， ST， Ward， S.P.， Millner， P.A.， Walker， A.R.， Schulz， B. 和 Feldmann， K.A. （1996） 拟南芥 AUX1 基因：根向重力的通透酶样调节因子。科学， 273， 948–950.
Bennett， MJ， Marchant， A.， Green， H.G.， May， ST， Ward， S.P.， Millner， P.A.， Walker， A.R.， Schulz， B. 和 Feldmann， K.A. （1996） 拟南芥 AUX1 基因：根向重力的通透酶样调节因子。 科学， 273， 948–950.
Bennett， MJ， Marchant， A.， Green， H.G.， May， ST， Ward， S.P.， Millner， P.A.， Walker， A.R.， Schulz， B. 和 Feldmann， K.A. （1996） 拟南芥 AUX1 基因：根向重力的通透酶样调节因子。科学， 273， 948–950.

Blilou， I.， Xu， J.， Wildwater， M.， Willemsen， V.， Paponov， I.， Friml， J.， Heidstra， R.， Aida， M.， Palme， K. 和 Scheres， B. （2005） PIN 生长素外排促进剂网络控制拟南芥根的生长和模式化。
Blilou， I.， Xu， J.， Wildwater， M.， Willemsen， V.， Paponov， I.， Friml， J.， Heidstra， R.， Aida， M.， Palme， K. 和 Scheres， B. （2005） PIN 生长素外排促进剂网络控制拟南芥根的生长和模式化。

自然， 433， 39-44.
自然， 433， 39-44.

Bubner， B. 和 Baldwin， I.T. （2004） 使用实时 PCR 测定转基因植物的拷贝数和合度。植物细胞代表 23， 263– 271。
Bubner， B. 和 Baldwin， I.T. （2004） 使用实时 PCR 测定转基因植物的拷贝数和合度。植物细胞代表 23， 263– 271。

Chang， C.R.， 胡， Y.B.， Sun， S.B.， Zhu， Y.Y.， 马， G.J. 和 Xu， G.H. （2009） 质子泵 OsA8 与水稻中的磷吸收和易位有关。J Exp Bot 60， 557–565。
Chang， C.R.， 胡， Y.B.， Sun， S.B.， Zhu， Y.Y.， 马， G.J. 和 Xu， G.H. （2009） 质子泵 OsA8 与水稻中的磷吸收和易位有关。J Exp Bot 60， 557–565。

Chen， R.J.， Hilson， P.， Sedbrook， J.， Rosen， E.， Caspar， T. 和 Masson， P.H. （1998） 拟南芥 AGRAVITROPIC 1 基因编码极性生长素转运外排载体的一个组成部分。Proc. Natl Acad. Sci.
Chen， R.J.， Hilson， P.， Sedbrook， J.， Rosen， E.， Caspar， T. 和 Masson， P.H. （1998） 拟南芥 AGRAVITROPIC 1 基因编码极性生长素转运外排载体的一个组成部分。Proc. Natl Acad. Sci.

美国，95,15112–15117。
美国，95,15112–15117。

Chen， T.L.， Lin， Y.L.， Lee， Y.L.， Yang， N.S. 和 Chan， M.-T.（2004） 转基因水稻细胞悬浮培养物中生物活性人干扰素-γ 的表达。转基因研究 13， 499–510。
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Chen， A.， 胡， J.， Sun， S. 和 Xu， G. （2007） 磷酸盐和菌根调节的生理反应和磷酸盐转运蛋白在茄科物种中的表达模式的守恒和分歧。新植物醇。173, 817–831.
Chen， A.， 胡， J.， Sun， S. 和 Xu， G. （2007） 磷酸盐和菌根调节的生理反应和磷酸盐转运蛋白在茄科物种中的表达模式的守恒和分歧。新植物醇。173, 817–831.

Cornejo， M.J.， Luth， D.， Blankenship， K.M.， Anderson， O.D. 和 Blechl， A.E. （1993） 玉米泛素启动子在转基因水稻中的活性。植物 Mol.
Cornejo， M.J.， Luth， D.， Blankenship， K.M.， Anderson， O.D. 和 Blechl， A.E. （1993） 玉米泛素启动子在转基因水稻中的活性。植物 Mol.

生物学 23， 567–581。
生物学 23， 567–581。

Dai， Y.， Wang， H.Z.， Li， B.H.， Huang， J.， Liu， X.F.， 周， Y.H.， Mou， Z.L. 和 Li， J.Y. （2006） MAP 激酶KINASE7表达增加导致极性生长素运输缺陷，并导致拟南芥植物结构异常。植物细胞，18,308-320。
Dai， Y.， Wang， H.Z.， Li， B.H.， Huang， J.， Liu， X.F.， 周， Y.H.， Mou， Z.L. 和 Li， J.Y. （2006） MAP 激酶 KINASE7 表达增加导致极性生长素运输缺陷，并导致拟南芥植物结构异常。植物细胞，18,308-320。

Feraru， E. 和 Friml， J. （2008） PIN 极性定位。植物生理学147， 1553–1559。
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Fu， X. 和 Zuo， J. （2007） PAT：唤醒一个懒惰的睡美人。细胞分辨率
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Geisler， M. 和 Murphy， A. （2006） 生长素运输的基础知识：p-糖蛋白在植物发育中的作用。FEBS Lett. 580， 1094–1102.
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Jin， J.， Huang， W.， Gao， J.P.， Yang， J.， Shi， M.， Zhu， M.Z.， Luo， D. and Lin， H.X. （2008） 驯化下水稻植物结构的遗传控制。
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Nat. Genet.40, 1365–1369.
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Luschnig， C. （2001） 生长素运输：为什么植物喜欢大思考。电流。生物。
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McSteen， P. （2010） 生长素和单子叶植物发育。冷泉港。
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透视。生物学 2，a001479。
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Muday， G.K. 和 Rahman， A. （2008） 生长素运输和重力生长的整合。在植物趋向性中（Gilroy， S. 和 Masson， PH，编辑），第
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47–78.英国，牛津：Blackwell Publishing Ltd.
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Myers， A.B.， Firn， R.D. 和 Digby， J. （1994） 引力符号反转——一些植物器官中引力感知或反应机制的基本特征。J. Exp. Bot.45, 77–83.
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Nagashima， A.， Uehara， Y. 和 Sakai， T. （2008） ABC 亚家族 B 生长素转运蛋白 AtABCB19 参与 N-1 萘邻苯二甲酸对拟南芥下胚轴的向光性和向重力反应的抑制作用。植物细胞生理学 49， 1-250。

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Okada， K.， Ueda， J.， Komaki， M.K.， Bell， CJ 和 Shimura， Y. （1991） 拟南芥花芽形成早期阶段生长素极性运输系统的要求。植物细胞，3,677-684。

Palme， K.， Dovzhenko， A. 和 Ditengou， F.A. （2006） 生长素运输和引力研究：观点。原生质体，229,175-181。
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Paponov， I.， Teale， W.， Trebar， M.， Blilou， I. 和 Palme， K. （2005） PIN 生长素外流促进剂：进化和功能观点。趋势植物科学 10， 170-177。

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Rahman， A.， Takahashi， M.， Shibasaki， K.， Wu， S.， Inaba， T.， Tsurumi， S. 和 Baskin， T.I. （2010） 拟南芥根的向重力作用需要 PIN2 向分生组织皮质细胞中的根尖极化。植物细胞，22,1762-1776 年。
Rahman， A.， Takahashi， M.， Shibasaki， K.， Wu， S.， Inaba， T.， Tsurumi， S. 和 Baskin， T.I. （2010） 拟南芥根的向重力作用需要 PIN2 向分生组织皮质细胞中的根尖极化。植物细胞，22,1762-1776 年。

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Shimizu-Sato， S.， Tanaka， M. 和 Mori， H. （2009） 生长素-细胞分裂素相互作用在芽分枝控制中的应用。植物分子生物学69， 429–435。
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Shin， H.， Shin， H.-S.， Guo， Z.， Blancaflor， EB， Masson， PH 和 Chen， R. （2005） 斑蝥素敏感蛋白磷酸酶对拟南芥 AGR1 ⁄ PIN2 介导的根系向重力反应和基瓣生长素转运的复合物调节。植物 J. 42， 188-200。
Shin， H.， Shin， H.-S.， Guo， Z.， Blancaflor， E.B.， Masson， P.H. 和 Chen， R. （2005） 斑蝥素敏感蛋白磷酸酶对拟南芥 AGR1 PIN2 介导的根系偏重反应和基瓣生长素转运的复合物调节。植物 J. 42， 188-200。

Sun， Y.， Yang， Y.， Yuan， Z.， Muller， J.L.， Yu， C.， Xu， Y.， Shao， X.， Li， X.， Decker， E.L.， Reski， R. and Huang， H. （2010） 拟南芥基因 UPRIGHT ROSETTE 的过表达揭示了吲哚-3-乙酸的稳态控制。植物生理学153， 1311–1320。
Sun， Y.， Yang， Y.， Yuan， Z.， Muller， J.L.， Yu， C.， Xu， Y.， Shao， X.， Li， X.， Decker， E.L.， Reski， R. and Huang， H. （2010） 拟南芥基因 UPRIGHT ROSETTE 的过表达揭示了吲哚-3-乙酸的稳态控制。 植物生理学 153， 1311–1320。
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Upadhyaya， N.M.， Surin， B.， Ramm， K.， Gaudron， J.， Schunmann， P.H.D.， Taylor， W.， Waterhouse， P.M. 和 Wang， M.B. （2000） 使用改良启动子和选择性标记物对澳大利亚水稻品种 Jarrah 和 Amaroo 进行农杆菌介导的转化。Aust. J. 植物生理学。
Upadhyaya， N.M.， Surin， B.， Ramm， K.， Gaudron， J.， Schunmann， P.H.D.， Taylor， W.， Waterhouse， P.M. 和 Wang， M.B. （2000） 使用改良启动子和选择性标记物对澳大利亚水稻品种 Jarrah 和 Amaroo 进行农杆菌介导的转化。Aust. J. 植物生理学。

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Wang， Y.H. 和 Li， J.Y. （2005） 水稻 （Oryza sativa） 的植物结构。
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植物分子生物学59， 75-84。
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Wang， Y. 和 Li， J. （2008） 水稻，上升。Nat. Genet.40, 1273–1275.
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Wis'niewska， J.， Xu， J.， Seifertova'， D.， Brewer， P.B.， Ru° zˇicˇka， K.， Blilou， I.， Rouquie'， D.， Benkova'， E.， Scheres， B. and Friml， J. （2006） 极性 PIN 定位指导植物中的生长素流动。 科学， 312， 883.
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Woodward， A.W. 和 Bartel， B. （2005） 生长素：调节、作用和相互作用。Ann. Bot.95, 707–735.
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Xu， Y.， Mccouch， S.R. 和 Shen， Z. （1998） 互补基因作用引起的水稻分蘖角的越界分离。作物科学 38， 12-19。
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Xu， M.， Zhu， L.， Shou， H.X. 和 Wu， P. （2005） PIN1 家族基因 OsPIN1 参与水稻生长素依赖性不定根出苗和分蘖。植物细胞生理学 46， 1674–1681。

Yang， L.T.， Ding， J.Y.， Zhang， C.M.， Jia， J.W.， Weng， H.B.， Liu， W.X. and Zhang， D.B. （2005） 通过实时定量 PCR 估计转化水稻中转基因的拷贝数。植物细胞代表 23， 759–763。
Yang， L.T.， Ding， J.Y.， Zhang， C.M.， Jia， J.W.， Weng， H.B.， Liu， W.X. and Zhang， D.B. （2005） 通过实时定量 PCR 估计转化水稻中转基因的拷贝数。植物细胞代表 23， 759–763。

Yoshihara， T. 和 Iino， M. （2007） 重力相关水稻基因 LAZY1 的鉴定和 LAZY1 依赖性和 -非重力信号通路的阐明。植物细胞生理学48， 678–688。
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Yu， B.， Lin， Z.， Li， H.， Li， X.， Li， J.， Wang， Y.， Zhang， X.， Zhu， Z.， Zhai， W.， Wang， X.， Xie， D. and Sun， C. （2007） TAC1，控制水稻分蘖角的主要数量性状位点。植物 J. 52， 891–898。
Yu， B.， Lin， Z.， Li， H.， Li， X.， Li， J.， Wang， Y.， Zhang， X.， Zhu， Z.， Zhai， W.， Wang， X.， Xie， D. and Sun， C. （2007） TAC1，控制水稻分蘖角的主要数量性状位点。 植物 J. 52， 891–898。
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支持信息
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图 S1 OsPIN2 的基因结构和跨膜拓扑模型。

图 S2 PIN2 的序列比较。图 水稻 7 个 PIN 家族基因和 WT 、 O1 和 O2 根和叶中 OsAUX1 的 S3 RT-PCR 分析。图 S4 WT、O1 和 O2 根和叶中 OsABCB1 和 OsABCB19 的 RT-PCR 分析。

表 S1 OsPIN2 基因引物。

表 S2 转基因细胞系中通过实时定量 PCR 确定的拷贝数。

表 S3 用于检测 OsACT 、 OsTAC1 、 OsLazy1 、 OsPINs、 OsAUX1 、 OsABCB1 和 OsABCB19 基因表达的引物。

表 S4 田间小区轨迹中 WT 和 O1 的产量。

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