Auxins reverse plant male sterility caused by high temperatures
叶黄素能逆转高温导致的植物雄性不育
Tadashi Sakata、Takeshi Oshino、Shinya Miura、+6 和 Atsushi Higashitani ahigashi@ige.tohoku.ac.jp 作者信息与工作单位
加州大学拉霍亚分校马克-埃斯特尔编辑,2010 年 4 月 1 日批准(2010 年 1 月 23 日收到审稿)
Abstract 摘要
随着全球变暖,植物高温伤害问题日益严重。在小麦、大麦和其他各种重要的商业作物中,花药发育的早期阶段特别容易受到高温的影响。有报道称,温度升高会激活某些植物组织中的辅助素生物合成。相比之下,我们在这里发现,在高温条件下,大麦和拟南芥花药发育过程中的内源辅酶水平会明显下降。此外,YUCCA 辅助素生物合成基因的表达也受到温度升高的抑制。施用辅助素能完全逆转这两种植物的雄性不育。这些发现表明,组织特异性辅助素减少是高温伤害的主要原因,高温伤害导致花粉发育中止。因此,在未来气候变化的情况下,施用辅助素可能有助于维持作物的稳定产量。
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植物的繁殖过程受到近期全球变暖造成的高温(HT)伤害的威胁(1)。Lobell 和 Field ( 2) 报告说,至少就小麦、玉米和大麦而言,全球作物产量与气温升高之间存在明显的负相关。此前,我们用双行大麦证明,温度升高主要影响花药发育的早期阶段,导致花粉母细胞减数分裂过早进行,花药壁细胞增殖停止并过早退化(3-5)。在花药发育的早期阶段,如果温度升高持续 4 天或更长时间,就会导致完全雄性不育,因为花粉粒会凋落 ( 3, 4)。高温损伤会导致多种形态异常,包括线粒体肿胀和空泡化,以及花药壁细胞转录的全面改变 ( 5)。在小麦、番茄、豇豆和拟南芥等其他温度胁迫植物物种中,也能广泛观察到花粉发育中止导致的雄性不育现象(6- 10)。然而,高温损伤的分子和生理机制以及逆转这种损伤的方法尚未完全确定。
叶绿素是一种植物激素,能协调许多生理和发育过程 ( 11)。人们还知道,HT 能促进拟南芥中由叶绿素介导的下胚轴伸长(12)。伸长所需的色氨酸氨基转移酶编码基因 TAA1/TIR2 参与了几种辅助素生物合成途径之一(13,14)(15)。随着温度的升高,该基因在下胚轴、子叶和根部的表达受到正向调节(15)。拟南芥的两种细胞色素 P450,即 CYP79B2 和 CYP79B3,通过中间体吲哚-3-乙酰醛肟(IAOx)参与色氨酸依赖性辅助素生物合成的其他途径,也在下胚轴伸长中发挥作用(16)。此外,与不同途径的 IAOx 生物合成有关的 YUCCA 黄素单加氧酶的表达在发育中的花药中受时间和空间控制(17-19)。在拟南芥中,包括 yuc2 和 yuc6 的双突变体或三突变体完全丧失雄性生育能力,并形成缺乏花粉粒的短雄蕊 ( 17)。有趣的是,这些突变体的表型与 HT 对雄性生殖发育的伤害非常相似,而 HT 通常会增加某些其他组织中的辅助素水平。在此,我们利用大麦和拟南芥研究了温度升高对内源辅助素和 YUCCA 基因表达的影响,以及应用外源辅助素逆转 HT 导致的雄性不育。
Results and Discussion 结果与讨论
Increasing Temperatures Reduce Endogenous Auxin and the Auxin Response in Developing Anthers.
温度升高会降低发育中花药的内源叶绿素和叶绿素反应。
为了确定辅助素与 HT 损伤之间的关系,我们测量了内源辅助素水平和辅助素信号转导活性。在大麦中,我们观察到正在发育的花药中的内源辅助素水平会因 HT 而降低(图 1)。在未处理的对照组(5 毫米长的圆锥花序)中,整个发育中的花药细胞,即顶叶细胞、表皮细胞和孢子细胞,以及维管束周围的轴细胞中都大量积累了辅酶(图 1 B 和 D)。这一发育阶段恰好是顶叶细胞的绦层、中层和内皮细胞发育之前(4, 5)。在暴露于高温下 <3 天的植株中,未观察到形态异常,温度降低后雄性繁殖力恢复 ( 3, 4)。另一方面,当 HT 处理 3 天后,检查 5 毫米长的圆锥花序时,花药顶叶和表皮细胞的辅助素水平显著下降,与对照植株的水平相比,每个花药子房每面积的荧光信号强度下降了 52.9%(图 1 H 和 J)。然而,HT 使维管束周围轴细胞的信号强度增加了 148.7% 以上(图 1 H 和 J)。当将 10 毫米长的圆锥花序暴露于 HT 5 天后进行检测时,花药中心的花粉母细胞和花粉块细胞中的辅助素水平进一步降低(强度降低 39.4%)(图 1 F 和 L)。
与花药细胞中的 GUS 染色不同,雌蕊群顶部和花瓣维管细胞周围的信号不仅在第 10 期(图 2)随温度升高而放大,而且在早期也是如此(图 3 A-C)。在后期的成熟花朵中,仍能观察到 HT 在心皮维管细胞周围的诱导作用(图 3 D-F)。然而,在 HT 条件下,早期和晚期花药细胞中的信号均消失(图 3)。在幼苗中,HT 处理增加了子叶叶柄、下胚轴和根中心圆柱体中的 DR5-GUS 信号(图 3 G-I)。这些结果清楚地表明,HT 处理以花药细胞特异性的方式抑制了辅助素信号转导,导致拟南芥花粉发育和花丝伸长与在大麦中观察到的类似流产。
Effect of High Temperature on Expression of YUCCA Auxin Biosynthesis Genes.
高温对 YUCCA 叶绿素合成基因表达的影响
为了研究高温对某些辅助素相关基因表达的影响,我们使用立体显微镜对第 9 期拟南芥花药进行了解剖。对YUCCA基因YUC2和-6的实时RT-PCR检测显示,温度升高到33 °C后1天,YUC2和-6的表达明显受到抑制(图4A)。33 ℃ 3 天后,YUC6 的表达量减少得更为严重。TAA1/TIR2 的表达在 3 天后也有所降低(图 4A)。在对照植株中,辅助素诱导基因 IAA1 ( 22) 的表达在第 9 阶段很弱 ( 19)。然而,在 HT 条件下,IAA1 的表达量减少了≈50%(图 4A)。虽然用 HT 处理了 3 天,但我们没有检测到第 9 期花药中的辅助素受体基因 TIR1 ( 23) 或参与茉莉酸产生和花成熟的 ARF6 和 ARF8 ( 24) 的表达有任何变化(图 4A)。在正常条件下,HarvEST:Barley Version 1.68 Assembly No.35中的大麦YUCCA基因unigene 31993号和5729号在圆锥花序早期发育过程中的表达量增加,但在温度升高的情况下,无法检测到31993号基因表达量的上调,而5729号基因的表达量则被严重抑制至正常水平的60%以下(图4 B和C)。
最近的拟南芥研究报告称,叶绿素会影响花粉成熟、花丝生长和花药开裂 ( 17, 19)。在花期 8-11 期,最有可能在发育中的花药细胞中生物合成辅酶,辅酶反应在花期 9 期后开始出现 ( 19)。辅助素生物合成基因 YUC2 和 -6 在花药细胞中强烈表达;它们的失活导致雄蕊短小,很少产生花粉(17)。因此,在拟南芥和大麦植物发育中的花药细胞中,辅助素生物合成基因的表达易受温度升高的影响。这些基因表达的减少可能会导致花药特异性的辅酶耗竭,并降低辅酶反应。
我们之前的研究结果也表明,HT 能诱导大麦幼苗中的辅助素响应基因表达,但不能诱导圆锥花序中的辅助素响应基因表达 ( 5)。此外,图 1- 3 显示 HT 对发育中的花药细胞和其他组织(尤其是维管细胞周围)的内源辅素水平和辅素信号转导的影响相反,即前者降低,后者升高。因此,HT 对植物组织间的辅素水平的影响似乎是不同的。此外,在拟南芥中,辅助素转运和感知突变体显示出花丝长度的减少,但对花粉成熟和花药开裂的影响不大(19)。同样,使用辅助素运输抑制剂也不会影响花药中的 DR5-GUS 染色(19)。这些结果表明,正在发育的花药中内源辅素的生物合成是导致 HT 引起的花粉流产和辅素减少的主要因素。因此,可以通过控制花药特异性的辅助素生物合成基因来获得耐 HT 植物。
Male Sterility Can Be Rescued by Exogenous Auxin Application.
雄性不育可以通过施用外源紫外光素来挽救。
为了评估外源施用的辅助素如何影响 HT 对花药早期发育的伤害,我们施用了 10 −6 、10 −5 或 10 −4 M 吲哚-3-乙酸(IAA;天然辅助素)或合成辅助素 1-萘乙酸(NAA)或 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。对照组或含辅助剂的溶液含有 0.1% DMSO 和 0.1% (体积分数)吐温 20。溶液在第 18、19、21 和 23 天上午施用到大麦植株上(图 5A)。在头状花序阶段,对照花药的长度为 2.99 ± 0.05 毫米,而暴露在高温下的花药长度仅为 1.48 ± 0.04 毫米,且不含花粉粒(图 5 B 和 C)。无论使用哪种助长化合物,施用助长素都能以剂量依赖的方式恢复花药长度(1.8-2.5 毫米)、成熟花粉粒(图 5)和结实率(图 6)。虽然施用 10 −4 M 2,4-D 后花药发育正常,但仍发现了辅助剂的负面影响,包括叶片过早枯萎和成熟种子的损失(图 6)。在 HT 条件下,两次施用叶绿素(第 19 天和第 21 天)足以恢复花药的发育(图 S2)。在 HT 条件下,我们观察到某些复制相关基因(包括 DNA 复制许可因子 MCM5)的转录抑制以及花药壁细胞和孢子细胞的细胞增殖停滞 ( 5)。施用外源辅助素可以完全恢复 MCM5 基因的表达(图 S3),它很可能能促进花药细胞的正常增殖和发育。
在将温度升高到 31 °C之前,用 10 −7 或 10 −6 M IAA 或含有 0.1% DMSO 的 NAA 溶液喷洒每个拟南芥花序的先端一次。温度升高七天后,高温热损伤导致雄蕊长度显著减少,而在辅助素处理的植株中,这种减少可以剂量依赖的方式被抑制(图 7 A 和 B)。在长度大于 1.0 毫米的雄蕊中,成熟花粉在碘溶液中染色正常。这些结果清楚地表明,雄性组织特异性辅助素的减少是 HT 损伤的主要原因。此外,由此导致的花粉发育中止和雄性不育可以通过施用外源辅助素来逆转。这些现象不仅在单子叶植物中高度保守,在双子叶植物中也是如此。迄今为止,辅酶已被广泛用作强效的选择性除草剂。我们的研究结果表明,在全球变暖的条件下,辅助素对促进植物生育和保持作物产量非常有用。
Materials and Methods 材料与方法
Plant Materials and Growth Conditions.
植物材料和生长条件
在正常条件下,双行大麦植株(H. vulgare L. cv "Haruna-nijyo")的整个生长期都被置于生长柜(LH350S,NK 系统)中,白天温度为 20 °C,夜间温度为 15 °C,光周期为 16 小时。如上所述,在五叶期(2 毫米长的圆锥花序),即第五片叶的顶端出现时开始进行 HT 处理。植物在白天 30 °C、夜间 25 °C的条件下生长 5 天(3- 5)。在此期间,花粉母细胞和花粉块细胞分别从花药的孢子细胞和顶叶细胞发育而来 ( 4, 5)。拟南芥哥伦比亚(野生型)及其表达 GUS 报告基因的衍生物在 23 °C(昼夜)的生长室中生长,光周期为 16 小时。为了研究温度升高对生殖发育的影响,我们对转移到 31 °C 或 33 °C 生长室、光周期为 16 小时的植株的初级花序进行了监测。
Auxin Application. Auxin 应用。
我们评估了外源施用的辅助素对花药早期发育过程中 HT 损伤的影响。用 6 mL 含有辅助素的溶液 [0.1% DMSO 和 0.1% (vol/vol) Tween 20] 喷洒整个大麦嫩枝,这些溶液分别是对照溶液或 10 −7 、10 −6 、10 −5 或 10 −4 M 溶液。在第 18、19、21 和 23 天上午施用天然辅助剂 IAA 或合成辅助剂 NAA 或 2,4-D(图 4)。拟南芥处理的助剂溶液中剔除了吐温 20。在发生温度上移的当天上午,在每株拟南芥的花序上喷洒一次≈0.1毫升的助长素溶液。温度上移 7-11 天后,观察成熟花朵的雄蕊长度和花粉形态。在一个花盆中种植 10 到 12 株植物,每个处理使用三个花盆进行一系列实验。每组实验均独立进行,一式三份。
Cytological and Expression Analyses.
细胞学和表达分析
使用体视显微镜和 CCD 摄像机(SZX12 和 DP20;奥林巴斯)对大麦花药和拟南芥雄蕊进行解剖后,分别在头状花序期和开花期进行测量。花药中的花粉粒用碘溶液(Lugol solution; MERCK)染色。深棕色的花粉粒即为成熟花粉。用扫描电子显微镜(SEM:JEOL JSM-5800LV,5 kV)观察拟南芥成熟的花朵,将切除的花朵在 FAA [3.7% 甲醛、50% 乙醇和 5% 冰醋酸(体积分数)] 中室温固定 3 小时,用乙醇脱水,换上乙酸异戊酯,再用临界点干燥器(JEOL JCPD-5)干燥。
我们研究了在施加或不施加 HT 胁迫 3 天后,早期发育的大麦圆锥花序(5 毫米长,即顶叶细胞、中层细胞和内皮细胞发育之前)中 IAA 的分布情况。如前所述,使用抗 IAA 单克隆抗体(25)检测 IAA,并做如下修改。为了交联 IAA,切除的圆锥花序立即在室温下用 3%(重量/体积)EDAC(Sigma-Aldrich)预固定 2 小时,然后转移到 FAA 中在 4 °C 下固定 24 小时。固定的圆锥花序在一系列乙醇和叔丁醇洗涤中脱水,然后包埋在石蜡中(PARAPLAST Plus,Oxford Labware)。用显微切片机对样本进行连续切片(10 微米厚),然后贴在涂有 MAS 的载玻片上(Matsunami Glass Industry)。在 42 °C 下干燥过夜后,用二甲苯对切片进行脱石蜡处理,并用乙醇-水系列进行水合处理。将样本在含有 0.1% (体积分数)吐温 20、1.5% 甘氨酸和 5% BSA 的 10 mM PBS(PBS;2.68 mM KCl、0.15 M Na 2 HPO 4 和 0.086 M KH 2 PO 4 )中于 22 ℃ 温育 45 分钟。然后用常规盐冲洗液[RSRS;10 mM PBS、0.88% NaCl、0.1%(体积分数)吐温 20 和 0.8% BSA]冲洗样品,并用含 0.8% BSA 溶液的 10 mM PBS(PBS+BSA)短暂洗涤以去除吐温 20。在每张载玻片上涂抹抗-IAA 单克隆抗体(编号 A0855,Sigma-Aldrich;400 μL 1:1,000 稀释液,来自 2.1 mg/mL 储存液)后,将样品置于室温湿度箱中孵育过夜。杂交后,对样本进行一系列剧烈冲洗,两次用高盐冲洗液[HSRS;10 mM PBS、2.9% NaCl、0.1%(体积分数)Tween 20 和 0.1% BSA]冲洗 10 分钟,一次用 RSRS 冲洗 10 分钟,再用 PBS+BSA 短时间冲洗。然后将 Alexa 488 结合的山羊抗小鼠 IgG 抗体(Invitrogen;400 μL 1:300 稀释的 2 mg/mL 储存液)置于每张载玻片上,并在室温湿度箱中孵育 4-6 小时。用 RSRS 冲洗两次,每次 15 分钟,然后用抗褪色试剂(ProLong Gold;Molecular Probes)装片,盖上盖玻片,在荧光显微镜(BX51;Olympus)下观察。荧光信号的强度由 Image J 软件测量。
GUS 染色方法如下:拟南芥花序在-20 °C下用丙酮(90%)固定 2 小时,然后用 2 mM 铁氰化钾和 2 mM 铁氰化钾在 Na 磷酸盐缓冲液(染色缓冲液)中浸润 15 分钟。然后将样品放入 2 mM X-Gluc(染色缓冲液)中于 37 °C下孵育 15 小时(花序)或 0.5 小时(幼苗),并用霍耶氏培养基清除整个组织。使用 DIC 光学仪器(BX51;奥林巴斯)进行观察。为了检测组织中的 GUS 表达模式,染色后的样品在室温下用 FAA 固定 30 分钟。然后将样本脱水,包埋在石蜡中,并以 10 μm 厚度连续切片。
使用 TRIzol Reagent(Invitrogen 公司)从大麦圆锥花序和拟南芥雄蕊中分离总 RNA。使用 SYBER ExScript RT-PCR Kit(TaKaRa)进行实时定量 RT-PCR,引物组见表 S1。在一系列实验中对每个样本进行了一式三份的 PCR,每一系列实验均以生物三联法进行。
Statistical Analysis. 统计分析。
统计数据用 MS Excel 计算。统计显著性采用非配对的学生双尾 t 检验。当 P < 0.05 时,结果具有统计学意义。
Acknowledgments 致谢
我们对以下人员表示感谢:感谢密苏里大学 T. J. Guilfoyle 博士(密苏里州哥伦比亚市)、北卡罗来纳大学 J. W. Reed 博士(北卡罗来纳州教堂山市)以及俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心(俄亥俄州哥伦布市)提供 DR5、ARF6、-8 和 -19 GUS 重组品系以及野生型 A.J. S. Heslop-Harrison、F. Berger 和 Y. Hotta 博士对手稿的审阅;以及 C. Watanabe、N. Fujii 和 T. Sato 提供的有益建议。这项工作的部分经费来自文部科学省补助金 21-COE、G-COE、18075003、1807512、20678001 和 19043004;农业、渔业和食品部补助金 IPG-0019;以及日本太空论坛推动的太空利用地面研究公告。本作品基于 A.H.、T.S. 和 M.W. 的专利 PCT/JP2010/50101。
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References 参考资料
政府间气候变化专门委员会第四次评估报告》(剑桥大学出版社,英国剑桥,2007 年)。
DB Lobell, CB Field, 全球尺度气候-作物产量关系及近期变暖的影响。Environ Res Lett 2, 014002 (2007).
T Sakata, H Takahashi, I Nishiyama, A Higashitani, Effects of high temperature on the development of pollen mother cells and microspores in barley Hordeum vulgare L. J Plant Res 113, 395-402 (2000).
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