R E S E A R C H

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编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的ALDH6A1突变与髓鞘发育不良和短暂性甲基丙二酸尿症有关

朱利安·马卡迪尔、阿曼达·史密斯、丹妮拉·波尔、杰里米·施瓦岑特鲁伯、奥萨马·迪尔巴希、FORGE加拿大财团、雅塞克·马耶夫斯基、萨沙·费迪南杜斯、罗纳德·贾·万德斯、丹尼斯·布尔曼、金·M·博伊科特、普拉内什·查克拉博蒂和迈克尔·杰拉蒂

* Correspondence: jumarcadier@cheo.on.ca

1 加拿大安大略省渥太华东安大略省儿童医院遗传学系 作者信息的完整列表见文章末尾

© 2013 Marcadier 等人;被许可人 BioMed Central Ltd.这是一篇根据知识共享署名许可 （http://creativecommons.org/licenses/by/2.0） 条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用了原始作品。

Marcadier et al. Orphanet 罕见病杂志 2013， 8：98 http://www.ojrd.com/content/8/1/98

背景 甲基丙二酸半醛脱氢酶 （MMSDH） 参与缬氨酸和胸腺嘧啶 （MIM#603178） 的分解代谢分解。缬氨酸的代谢产生中间体（S）-3-羟基异丁酸（HIBA），被3-羟基异丁酸脱氢酶氧化为（S）-甲基丙二酸半醛（MMSA）。胸腺嘧啶代谢产生（R）-氨基异丁酸（AIBA），然后脱氨成（R）-甲基丙二酸半醛。MMSA的这两种对映异构体是MMSDH的底物，MMSDH催化其氧化脱羧为丙酰辅酶A（图1）。很少有病例报告描述了MMSDH缺乏症患者，并且所有病例都处于尿液中3-羟基异丁酸水平升高以及其他代谢异常的背景下。Pollitt等[1]的初步报告描述了一名无症状儿童，该儿童在新生儿筛查中因蛋氨酸水平高而被发现患有3-羟基异丁酸尿症，并最终显示在编码MMSDH的基因ALDH6A1中携带纯合错义突变（c.1336G > A）[2]。最近的一份报告描述了两名无关儿童的3-羟基异丁酸尿症和ALDH6A1不同的新型纯合错义突变[3]。两份报告均不能证明MMSDH酶活性降低

鉴于丙二酸甲酯半醛在酶测定中的不稳定行为。因此，直到最近，在ALDH6A1中发现有害突变一直是诊断MMSDH功能障碍的唯一方法。

在这份报告中，我们描述了一名患有严重发育迟缓、脑部 MRI 异常和甲基丙二酸 （MMA） 短暂升高的年轻女童，此外还有 3-羟基异丁酸和血浆乳酸水平升高。外显子组测序揭示了ALDH6A1中新的化合物杂合错义突变，随后对成纤维细胞的研究表明MMSDH酶活性降低。这是第四例由于ALDH6A1突变而导致MMSDH缺乏的儿童，也是第一例同时表现出酶水平缺乏的病例。这份报告扩展了我们对这种非常罕见疾病的生化和临床方面的理解，并强调它实际上可能被严重诊断不足，因为最初在我们的患者中观察到的许多生化异常在 18 个月大时已经恢复正常。

患者和方法 在本研究之前获得了机构研究伦理委员会的批准（安大略省东部儿童医院）。患者的父母为外显子组测序提供了知情同意书以及发表许可

图1 缬氨酸和胸腺嘧啶的分解代谢，导致甲基丙二酸半醛（MMSA）被甲基丙二酸半醛脱氢酶氧化脱羧成丙酰辅酶A。HIBA：3-羟基异丁酸;AIBA：3-氨基异丁酸。

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本报告中包含的临床信息和图像。

临床描述 患者 （AB），现 36 个月大，最初在 7 个月时因发育迟缓、畸形特征以及尿液和血浆甲基丙二酸略有升高而转诊。她出生于 40 + 5 周的妊娠期，父母是非血缘父母，怀孕和分娩都很顺利。出生体重为3657克（第75个百分位）。在3个月大时发现她肌肤低渗，视力固定和追踪困难，因此开始临床调查。到 19 个月大时，她进展缓慢，但继续表现出整体发育迟缓而没有退化。她可以在帮助下坐着，但无法爬行或拉动站立。发声由单音节噪音组成。她从未有过类似癫痫发作的发作。家族史仅对患有先天性耳聋的表亲有意义。

初步体格检查显示正常生长参数（头围 50% 、身长 75% 、体重 90-95 % ）。然而，头围的间隔增长尚未充分进展，在本报告撰写时处于第 10 个百分位。她的脸呈方形，额头略微凸起，额头高高的，头发稀疏。眼部表现包括双侧内眦赘皮、轻度眼距过长和双侧斑驳视网膜色素上皮。鼻子短而前倾，基部宽而平坦，人中短。她的嘴巴是帐篷，她的上颚是高拱的。双侧幻觉较宽，右手掌上有一手掌皱褶。轴向音调明显降低，周边音调波动。深部腱反射活跃，但没有踝阵挛。肌肉体积和力量正常，感觉基本完好无损。协调性不适合她的年龄，而且她的动作有肌张力障碍。6 个月时的检查显示 MMA 尿排泄增加，血浆 MMA 峰值水平为 4428 nmol/L（正常值：0-270 nmol/L），血浆乳酸水平为 5.6 mmol/L（正常值：0.5 - 2.2 mmol/L）。这些代谢物和其他代谢物水平随时间波动，无需干预，也与临床状态无关。最近在孩子身体健康时进行的测量显示血浆乳酸浓度升高，伴有尿MMA和β-丙氨酸升高，以及尿氨基异丁酸持续升高（图2）。虽然最初未被识别，但尿有机酸GCMS谱显示3-羟基丁酸升高。随后对m/z 191和m/z 177进行离子萃取，将峰分离为3-羟基丁酸酯和3-羟基异丁酸酯

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MMA或线粒体功能障碍的代谢。正是在这一点上，人们开始进行全外显子组测序，专门寻找可能属于这些类别的变异。

外显子组测序 我们遵循标准制造商的实验方案，使用Agilent SureSelect All Exon 50 MB （V3）外显子组富集试剂盒进行靶标捕获，并在Illumina HiSeq 2000上对100 bp配对末端读长进行测序，为样品生成了11.7 Gb的序列。我们使用Fastx工具包[5]删除了接头序列和质量修整的读取，然后使用自定义脚本来确保随后仅使用两个伴侣都存在的读取对。使用BWA 0.5.9 [6]对读与hg19进行比对，并使用GATK [7]进行插入缺失重新比对。然后使用Picard[8]标记重复读数，并将其排除在下游分析之外。我们使用 GATK 评估了共识编码序列 （CCDS） 碱基的覆盖率，结果显示样本中有 92.3% 的 CCDS 碱基被至少 10 个读长覆盖，87 个

至少 20 个读数覆盖了 8% 的 CCDS 碱基。使用samtools mpileup[9]和扩展碱基比对质量（BAQ）调整（−E）进行单核苷酸变体（SNV）和短插入和缺失（插入缺失）的调用，然后进行质量过滤，以需要至少20%的reads支持变体调用。使用Annovar [10]和自定义脚本对变异进行注释，以确定它们是否影响蛋白质编码序列，以及它们以前是否在dbSNP132 [11]、1000基因组数据集（2011年11月）[12]、NHLBI GO外显子组[13]或之前在我们中心测序的大约540个外显子组中出现过。

变异验证 Sanger测序用于验证通过下一代测序鉴定的突变，并评估家族中变异的分离。采集了血液样本，并从未受影响的父母和兄弟姐妹身上提取了DNA。使用引物 5′-GAAGGGCAAGTCAGTGTACC-3′ 和 5′-CAACA AACATGGAGGTTAAAATG-3′ 进行 PCR，以检测 c.514 T > C 变体和 5′-GATGGCTAAGGTTTGATTGTT

Age (months)

5 10 15 20 25 30

血浆乳酸 （mmol/L）

血浆 MMA （ mol/L）

尿液AIBA

（毫摩尔/摩尔铬）

Plasma AIBA

( mol/L)

尿

-丙氨酸

（毫摩尔/摩尔铬）

血浆

-丙氨酸

mol/L）

2.1 3.5

0 1 2

Urine MMA

(mmol/mol Cr)

图2 按时间顺序排列的选定调查大纲，随时间推移水平波动。变异性与饮食调整或药物治疗无关。正常范围由阴影区域表示。AIBA：3-氨基异丁酸。

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TAC-3′ 和 5′-GAAGAGCAAGTGAGAAATCTGG-3′ 测试 c.1603C > T 变体。

酶测定 在NAD和辅酶A存在下，使用丙二酸甲酯半醛作为底物进行酶活性测量。由于甲基丙二酸半醛是一种不稳定的化合物，因此在进行酶法测定之前，按所述合成了丙二酸甲酯半醛的缩二乙醛[14]，并按所述[15]水解。酶反应的产物丙酰辅酶A被肉碱乙酰转移酶（CRAT）转化为丙酰肉碱，

使用氘标记的丙酰肉碱作为内标通过串联质谱法检测（未发表的数据，描述制备中酶测定的手稿[16]）。通过测量来自对照受试者的 13 种不同培养的皮肤成纤维细胞系的 MMSDH 活性来确定参考值。

结果 全外显子组测序发现基因ALDH6A1 2个新变异，支持MMSDH缺乏症的诊断。共鉴定出32个变异，这些变异在拟合隐性疾病模型的同时影响蛋白质序列或经典剪接位点。中唯一看到的变体

图 3 13 个月和 21 个月大时拍摄的 MRI 图像。（甲、乙）轴向 FLAIR 图像显示髓鞘形成在 9 个月内仅出现最小的间隔进展，在 13 个月时脑室周围白质弥漫性变薄。（C、D）轴向 T2 加权图像显示髓鞘形成明显延迟，伴有轻度心室扩张和额叶轴外间隙轻微扩大。（英、女）矢状面 T2 加权图像显示弥漫性薄胼胝体。MR波谱显示NAA、肌酸和胆碱的峰值正常，并且没有乳酸峰值。

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MitoCarta数据库（1013个编码蛋白质的核和mtDNA基因的清单，具有线粒体定位的强力支持）[17]，均发生在ALDH6A1。外显子 12 （NM_005589， c.1603C > T） 中的错义突变导致终止密码子前最后一个氨基酸的精氨酸到半胱氨酸的变化 （p. Arg535Cys），在 6503 个 NHLBI 外显子组中仅以杂合子状态报道过一次 [13]，并且在 1000 个基因组数据集 [12] 或我们的测序设施研究的其他罕见疾病项目的 540 个外显子组中未见。外显子 6 （NM_005589， c.514 T > C） 中的第二个错义突变，产生酪氨酸到组氨酸的变化 （p. Tyr172His），在任何这些数据集中都没有报道。突变通过Sanger测序得到证实。此外，每个父母都被确认为其中一个突变的携带者。患者的健康兄弟姐妹没有携带任何一种突变。两种受影响的氨基酸残基在哺乳动物中都是高度保守的。SIFT [18]（评分分别为 0 和 0.01）和 Polyphen2 [19]（评分分别为 0.986 和 0.838）预测由此产生的氨基酸变化具有破坏性。对外显子组测序结果的进一步检查发现，已知与髓鞘发育不相关的基因中没有罕见变异，包括 PLP1、GJC2、AIMP1、HSP60、FAM126A、SLC16A2、LMNB1、SLC17A5 和 L1CAM。尽管进行了广泛的调查，但没有发现这个孩子的表型有其他原因。相比之下，外显子组测序不会对因果关系做出事先假设，因此在ALDH6A1（一种可能与生化结果合理相关的基因）中发现两个预测的致病突变强烈提示疾病因果关系。

遗传代谢疾病实验室（荷兰阿姆斯特丹学术医学中心）的成纤维细胞研究表明MMSDH的活性降低。测得的活性为36 pmol/（min.mg 蛋白）（正常范围51-184;平均值117;标准差±33）。

讨论 MMSDH缺乏症是一种极其罕见的常染色体隐性遗传缬氨酸和胸腺嘧啶代谢疾病。迄今为止，仅在三个个体中发现了ALDH6A1突变（总结在表1中）。在首例此类病例中，患者在新生儿筛查中偶然出现高蛋氨酸血症[1,20]。蛋氨酸升高与随后发现的持续性尿液和血浆异常无关，表现为β-丙氨酸、3-羟基丙酸、3-氨基异丁酸、3-羟基异丁酸和（S）-2-（羟甲基）丁酸升高。孩子在4岁时一直保持身体和发育良好。Chambliss等[2]的分子分析发现了一个纯合错义突变（c.1336G > A;

Gly446Arg）在脊椎动物中对甘氨酸残基具有100%保守性的ALDH6A1基因，并且在6503个NHLBI外显子组中未见。其余两例分子确诊病例由Sass等[3]报道。1 名儿童为近亲父母所生的欧洲男孩，表现为 3-羟基异丁酸升高，3-羟基丙酸和 2-乙基-3-羟基丙酸轻度升高。他有轻度发育迟缓和畸形，在26个月大时因继发于肝衰竭的急性肝脑病去世。尸检分析显示脑水肿伴白质空泡化和额叶皮层微钙化，这在活着时未在影像学检查中发现。他被发现是 ALDH6A1 年 c.785C > A （p. Ser262Tyr） 变化的纯合子。第二例病例为一名巴基斯坦裔年轻女孩，Shield等[21]曾报道过该病例。她是近亲结合的产物，有严重的发育迟缓、畸形特征、小眼症、白内障和产后小头畸形。1 岁时的脑部 MRI 显示髓鞘形成明显延迟、胼胝体变薄和小头畸形。尿有机酸显示 3-羟基异丁酸和 3-羟基丙酸水平升高。乳酸水平仅轻度升高。她是 ALDH6A1 年 c.184C > T （p. Pro62Ser） 突变的纯合子。值得注意的是，孩子的哥哥也被发现3-羟基异丁酸水平升高，没有乳酸性酸中毒，尽管没有分子分析报告。他的表型处于较温和的一端，伴有小头畸形和中度学习困难。他的脑部MRI仅显示孤立性小头畸形。 在欧洲和巴基斯坦病例中报告的突变发生在高度保守的氨基酸中，并被预测为致病。除了本文报道的病例外，这三个病例所表现出的临床和生化谱各不相同（表1），这表明需要对携带ALDH6A1突变的患者进行详细的基因型-表型相关性研究。

其他3-羟基异丁酸尿症的代谢特征提示MMSDH缺乏症的报道也有所报道，其临床和生化表现各不相同[22-28]。其中两例在培养的成纤维细胞中进行了负荷研究，表明MMSDH酶活性不足。第1例为男性，6岁时出现生长迟缓、呕吐、嗜睡和代谢性酸中毒[22,25]。尿液筛查显示3-羟基异丁酸和乳酸水平升高。体格检查发现细微的畸形，表现为小三角形脸，耳朵低位，第五指斜指，2/3脚趾并指。第2例为男性，在22月龄时，因肠旋转不良和Meckel憩室修复术前发现丙二酸甲酯和丙酰肉碱水平正常[26]。否则，他会在全球范围内延迟，并且从未发作过

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代谢性酸中毒。值得注意的是，在两个个体中都无法识别出ALDH6A1突变[2]。在研究时，没有证据表明成纤维细胞中MMSDH活性降低。

正如我们所强调的，MMSDH缺乏症的诊断是有问题的。病例报告极为罕见，表型似乎变化很大。这就提出了确定偏倚的问题——这是研究罕见的先天性代谢错误的常见并发症。进一步增加诊断难度的是，在我们患者身上看到的生化变化是短暂的和多样的。特别值得注意的是，当孩子大约 6 个月大时达到血浆 MMA 峰值水平，之后逐渐下降到正常范围（图 2）。这是在没有任何干预的情况下实现的——饮食、药理学或其他方面。血清 MMA 水平从 6 个月时的 4428 nmol/L 下降到 27.5 个月时的 90 nmol/L。18 个月大后，血浆乳酸水平长期正常，最近我们最近的调查显示，在 34.5 个月时，乳酸水平升高至 6.6 mmol/L。我们的研究未能发现尿液有机酸的异常，并且显示尿液氨基酸中氨基异丁酸和β丙氨酸略有升高

可以推测，异常发现对应于具有相关代谢物周转的生长高峰时间。与我们的情况一样，3-羟基异丁酸、氨基异丁酸和β-丙氨酸的轻度升高可能未被报告或遗漏，部分原因是 3-羟基异丁酸与 3-羟基丁酸同位素。3-羟基丁酸的升高是非特异性的，可归因于任何可能诱导生酮的过程。因此，如果不专门寻找3-羟基异丁酸酯，则很容易在质谱法中遗漏该化合物。因此，我们建议，轻度甲基丙二酸尿症的发现应促使仔细寻找与MMSDH缺乏相关的代谢物。

先前关于分子证实的MMSDH缺乏症的报道描述了各种脑部异常，包括出生后小头畸形、脑微钙化，以及在一例中，与脑水肿和死亡相关的急性肝脑病。我们报告了胼胝体发育不全，并在 13 至 21 个月大时严重延迟髓鞘形成（图 3）。Shield等[21]描述的患者在1岁时同样表现出髓鞘形成延迟。目前尚不清楚MMSDH缺乏将如何导致脑髓鞘发育不良和发育迟缓。人们可以推测半醛本身及其相关代谢物的毒性。有趣的是

Table 1 Clinical and biochemical summary of molecularly confirmed patients in the literature

Our patientt

Pollitt et al. [1] Shield et al. [21] Sass et al. [3] Gray et al. [20] Sass et al. [3] Chambliss et al. [2]

Patient information

Female

Female

男 欧洲混血 巴基斯坦血统 巴基斯坦血统 欧洲混血 父母 非血缘 未指定血缘关系 父母近亲 父母近亲

ALDH6A1 mutations c.514T > C

c.1336G > A c.184C > T

c.785C > A

c.1603C > T

c.1336G > A c.184C > T

c.785C > A

Biochemical

abnormalities

↑ 血浆/尿液 MMA ↑ 蛋氨酸 ↑ 3-羟基丙酸酯 ↑ 乳酸 ↑ 3-羟基丙酸酯 ↑ 柠檬酸甲酯 轻度 ↑ 3-羟基丙酸酯 ↑ HIBA ↑ HIBA 轻度 ↑ 乳酸 ↑ HIBA

↑ AIBA

↑ AIBA

↑ HIBA

↑ β-alanine

↑ β-alanine

↑ β-alanine ↑ AIBA

CNS findings Severe developmental

delays, dystonia and microcephaly.

正常发育 严重发育迟缓，肌张力减退和小头畸形。

早期延误，25个月纠正。

Relative microcephaly.

MRI 上的髓鞘形成延迟和胼胝体变薄

MRI 上没有影像学报告髓鞘形成延迟和胼胝体薄

未报告影像学检查。尸检时额叶皮层微钙化。

临床表现：前额高，内眦赘皮，轻度眼距过长，人中短，幻觉宽，右掌单皱褶。

Healthy Microphthalmia and

cataracts, diagnosed as

Warburg Micro 综合症。狭窄，向下倾斜的睑裂，鼻子短，鼻梁凹陷。

Bulbous nose,

long philtrum.

No reported

dysmorphisms

26个月时死于发热性疾病后的肝脑病和肝衰竭。

HIBA: 3-hydroxyisobutyric acid; AIBA: 3-aminoisobutyric acid.

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MMSDH在胸腺嘧啶分解代谢中也起作用，线粒体核苷酸库的紊乱与线粒体耗竭和脑病有关。例如，正如我们的案例所见，MMA和乳酸性酸中毒也是琥珀酰辅酶A连接酶缺乏症的特征。未来，通过在模型系统中设计MMSDH敲除器，可能会获得更多信息，尽管在撰写本文时还没有可用的信息。

外显子组测序在临床中的地位尚不清楚。在我们的案例中，它是在进行广泛的诊断检查后完成的。当然，在这名患者中，它可以避免进行肌肉活检的需要。同样，这是该疾病唯一可用的诊断测试，因为既没有酶学也没有单基因测试。此外，如果临床和实验室信息指向特定的通路或细胞器（如MMA代谢或线粒体疾病），这些信息可用于过滤测序数据，并增加找到明确答案的可能性，同时减少未知意义的变异数量。

结论 我们提出了第四例分子证实的MMSDH缺乏症，由ALDH6A1基因的复合杂合突变引起，也是第一例证明伴随酶活性降低的病例。本报告旨在说明这种罕见疾病中存在的临床和生化变异性，并强调了在MMA水平升高的背景下寻找特定代谢物的重要性。还说明了全外显子组测序与预定变异过滤相结合的新兴应用，作为诊断罕见和可变疾病的早期工具。最后，鉴于诊断的困难，我们怀疑这是一种未被充分认识的疾病，随着更多患者的发现，我们对这种罕见疾病的理解将会提高。

缩写MMSDH：甲基丙二酸半醛脱氢酶;ALDH6A1：醛脱氢酶6家族成员A1;MMA：甲基丙二酸;SIFT：将不耐受物从耐受物中分拣出来;PolyPhen-2：多态性表型。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

作者贡献 JLM 和 MTG 撰写了手稿。九巴和德铁设计并协调了这项研究。MTG、DP、OYA、PC 和 JLM 提供亚专科咨询服务、系列临床检查和诊断测试。JS和JM对二代测序数据进行了分析。AMS 和 KMB 安排了 ALDH6A1 基因的 Sanger 测序。RJAW和SF对成纤维细胞进行了生化测试。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

致谢 这项工作由加拿大政府通过加拿大基因组、加拿大卫生研究院和安大略基因组学研究所 （OGI-049） 资助。魁北克基因组组织、不列颠哥伦比亚省基因组组织和麦克劳克林中心提供了额外的资金。这项工作被FORGE加拿大联盟选中进行研究：在加拿大发现罕见病基因;指导委员会：Kym Boycott（领导人;渥太华大学）、Jan Friedman（联合负责人;不列颠哥伦比亚大学）、Jacques Michaud（联合负责人;蒙特利尔大学）、弗朗索瓦·伯尼尔（卡尔加里大学）、迈克尔·布鲁德诺（多伦多大学）、布里奇特·费尔南德斯（纪念大学）、巴塔·诺珀斯（麦吉尔大学）、马克·塞缪尔斯（蒙特利尔大学）、史蒂夫·舍勒（多伦多大学）。我们要感谢 Janet Marcadier（临床协调员）和 Chandree Beaulieu（项目经理）对 FORGE 加拿大联盟基础设施的贡献。作者希望感谢加拿大蒙特利尔麦吉尔大学和Génome Québec创新中心的高通量测序平台的贡献。我们要感谢阿姆斯特丹自由大学医学中心儿童神经病学系的 NI Wolf 博士、MS van der Knaap 博士、RJ Vermeulen 博士和 MSM van Breemen 博士在解释 MRI 图像方面的宝贵意见。作者详细信息 1加拿大安大略省渥太华市东安大略省儿童医院遗传学系。渥太华医院研究所，加拿大安大略省渥太华。3加拿大安大略省渥太华大学东安大略儿童医院神经内科儿科。麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心，加拿大魁北克省蒙特利尔。 安大略省新生儿筛查，安大略省东部儿童医院，加拿大安大略省渥太华。加拿大安大略省渥太华大学东安大略研究所儿童医院。实验室遗传代谢疾病，阿姆斯特丹大学学术医学中心，荷兰阿姆斯特丹。渥太华大学东安大略儿童医院代谢科儿科，加拿大渥太华 K1H8L1。收稿日期： 2013-04-10 录用日期： 2013-06-21 出版日期： 2013-07-09

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Marcadier et al. Orphanet Journal of Rare Diseases 2013, 8:98 Page 9 of 9

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