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图 7.7 提高退火温度对聚合酶链式反应保真度的影响。扩增的 DNA 是大肠杆菌 16 S rRNA 编码区的 1340 个碱基片段。车道 A , 37 ∘ C A , 37 ∘ C A,37^(@)C\mathrm{A}, 37^{\circ} \mathrm{C};车道 B , 45 ∘ C B , 45 ∘ C B,45^(@)C\mathrm{B}, 45^{\circ} \mathrm{C};车道 C , 55 ∘ C C , 55 ∘ C C,55^(@)C\mathrm{C}, 55^{\circ} \mathrm{C};车道 D， 60 ∘ C 60 ∘ C 60^(@)C60^{\circ} \mathrm{C};泳道 E，1 kb DNA 分子量标准（Bethesda Research Laboratories）。
图 7.7 提高退火温度对聚合酶链反应保真度的影响。扩增的 DNA 是大肠杆菌 16 S rRNA 编码区的 1340 碱基段。泳道 A , 37 ∘ C A , 37 ∘ C A,37^(@)C\mathrm{A}, 37^{\circ} \mathrm{C} ；泳道 B , 45 ∘ C B , 45 ∘ C B,45^(@)C\mathrm{B}, 45^{\circ} \mathrm{C} ；泳道 C , 55 ∘ C C , 55 ∘ C C,55^(@)C\mathrm{C}, 55^{\circ} \mathrm{C} ；泳道 D， 60 ∘ C 60 ∘ C 60^(@)C60^{\circ} \mathrm{C} ；泳道 E，1 千碱基 DNA 梯子（贝塞斯达研究实验室）。
三个因素对聚合酶链反应的特异性有很强的影响。它们是温度， Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+}浓度和 Taq 聚合酶浓度。降低温度并增加 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+}两者都增加了含有错配碱基对的杂交体的稳定性，因此有助于形成非特异性 PCR 产物。
有三个因素对聚合酶链反应的特异性有很大影响。它们是温度、 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+} 浓度和 Taq 聚合酶浓度。降低温度和增加 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+} 都会增加含有错配碱基对的杂交体的稳定性，从而导致非特异性 PCR 产物的形成。 Taq 聚合酶在常用的退火温度下保持活性，可能通过快速扩展错配杂交体来促进非特异性扩增。
Taq 聚合酶在常用的退火温度下仍有活性，它可能会通过快速扩展不匹配的杂交而导致非特异性扩增。
温度对非特异性 PCR 产物形成的影响如图 7.7 所示。在这里，随着退火温度的升高，非特异性 PCR 产物的形成被消除。
图 7.7 展示了温度对非特异性 PCR 产物形成的影响。在这里，随着退火温度的升高，非特异性 PCR 产物的形成被消除。

（v） 克隆扩增的基因  （v）克隆扩增的基因

1. “强制”克隆技术  1."强制 "克隆技术

限制性酶切位点被设计成的扩增引物可用于将限制性核酸内切酶识别位点引入扩增基因的末端（Scharf et al.， 1986）。Medlin 等人 （1988）
扩增引物中的限制性位点可用于在扩增基因的末端引入限制性内切酶识别位点（Scharf 等人，1986 年）。Medlin 等人（1988 年 使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点，这允许使用强制克隆程序。强制克隆具有明显的优势，即载体的多接头在两个不同的识别位点被切割后，不能在分子内反应中重新连接到自身身上。因此，高比例的转化体将包含可预测方向的克隆 PCR 产物。
限制性酶切位点被设计成的扩增引物可用于将限制性核酸内切酶识别位点引入扩增基因的末端（Scharf et al.，1986）。Medlin 等人（1988）使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点，这允许使用强制克隆程序。使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点，这允许使用强制克隆程序。强制克隆具有明显的优势，即载体的多接头在两个不同的识别位点被切割后，不能在分子内反应中重新连接到自身身上。因此，高比例的转化体将包含可预测方向的克隆 PCR 产物。
“强制克隆”技术的缺点是扩增的基因可能在内部限制性位点被切割。如果内部限制性位点离末端足够远，则从电泳凝胶上的迁移率变化或两个条带的出现中可以明显看出内部切割。如果多个条带很明显，则可以克隆每个条带以获得完整的基因。
"强制克隆 "技术的缺点是扩增的基因可能在内部限制性位点被切割。如果内部限制性位点离末端足够远，则从电泳凝胶上的迁移率变化或两个条带的出现中可以明显看出内部切割。如果多个条带很明显，则可以克隆每个条带以获得完整的基因。
强制克隆技术的第二个缺点是，位于 DNA 分子末端附近的限制性位点与限制性核酸内切酶的反应效率不如内部位点。例如，HpaII 和 MnoI 需要至少一个碱基位于 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}裂解识别序列的结束 （Baumstark等人，1979）。
强制克隆技术的第二个缺点是，位于 DNA 分子末端附近的限制性位点与限制性核酸内切酶的反应效率不如内部位点。例如，HpaII 和 MnoI 需要至少一个碱基位于 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 末端的识别序列进行裂解（Baumstark 等人，1979 年）。由于涉及的长度变化很小，因此不能使用迁移率偏移直接监测末端限制性位点消化的效率。然而，在这些情况下，连接测定可用于确定消化效率。在该检测中，消化的 PCR 产物与标准 DNA（例如噬菌体 lambda DNA）的相容限制性内切物混合，并使用 T4 DNA 连接酶连接。如果存在适当的粘性末端，则扩增的 DNA 分子将转化为异质大小的高分子量连接产物。否则，扩增产物的迁移率将不受连接的影响。
裂解识别序列的结束 （Baumstark 等人，1979）。由于涉及的长度变化很小，因此不能使用迁移率偏移直接监测末端限制性位点消化的效率。然而，在这些情况下，连接测定可用于确定消化效率。在该检测中，消化的 PCR 产物与标准 DNA（例如噬菌体 lambda DNA）的相容限制性内切物混合，并使用 T4 DNA 连接酶。如果存在适当的粘性末端，则扩增的 DNA 分子将转化为异质大小的高分子量连接产物。
避免内部限制性位点困难的一种方法是将“罕见”限制性位点掺入引物中。不幸的是，只有一种合适的酶 Not I 可用。这种方法尚未被证明是可行的，因为它与平末端连接相比没有优势，并且在消化 Not I 位点时遇到了困难（Tom Schmidt，个人通信）。
避免内部限制性位点困难的一种方法是将 "罕见 "限制性位点掺入引物中。不幸的是，只有一种合适的酶 Not I 可用。这种方法尚未被证明是可行的，因为它与平末端连接相比没有优势，并且在消化 Not I 位点时遇到了困难（Tom Schmidt，个人通信）。

2. 平末端克隆技术  2.平末端克隆技术

平末端连接程序是目前克隆 PCR 反应产物最实用的方法。平淡的双链 DNA 分子 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}磷酸盐和 3' 羟基可以通过 T4 DNA 连接酶连接。该反应不如“粘性末端”连接有效，可能是因为底物的非共价氢键使“粘性末端”反应基本上是一级的。
平淡的双链 DNA 分子 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 磷酸盐和 3' 羟基可以通过 T4 DNA 连接酶连接。该反应不如 "粘性末端 "连接有效，可能是因为底物的非共价氢键使 "粘性末端 "反应基本上是一级的。
酶促反应生成的双链分子通常具有 5' 磷酸基和 3' 羟基。合成的 DNA 分子缺乏 5' 磷酸盐，尽管这些磷酸盐可以在使用噬菌体 T4 多核苷酸激酶合成后添加。由于 3 ′ 3 ′ 3^(')3^{\prime}羟基不能连接到 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}hydroxyl，只有 3 ′ 3 ′ 3^(')3^{\prime}合成 DNA 的末端是连接反应的合适底物。
酶促反应生成的双链分子一般都有 5'磷酸和 3'羟基。合成的 DNA 分子缺乏 5'磷酸，不过可以在合成后使用噬菌体 T4 多核苷酸激酶添加这些磷酸。由于 3 ′ 3 ′ 3^(')3^{\prime} 羟基不能与 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 羟基连接，因此只有合成 DNA 的 3 ′ 3 ′ 3^(')3^{\prime} 端适合作为连接反应的底物。聚合酶链反应生成的 DNA 分子具有合成的 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}Termini， 缺乏 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}磷酸盐。因此，如果连接到平末端载体中，它们会在每条链上产生带有单个缺口的环状分子。幸运的是，这些有缺口的分子可以有效地转化细菌。
聚合酶链反应产生的 DNA 分子具有合成的 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 端部，缺乏 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 磷酸。因此，如果将它们连接到钝末端载体中，就会产生每条链上都有一个缺口的环状分子。幸运的是，这些有缺口的分子可以有效地转化细菌。许多方案要求在进行平末端连接之前将亲配对 PCR 片段作为初始步骤。这是不必要的，并且会使 PCR 片段与自身连接，形成环状和聚体。
许多方案都要求在进行钝端连接之前先将 PCR 片段连接起来。但这是不必要的，这样会使 PCR 片段与自身连接，形成圆环和连接体。
酶促去除也很常见 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime}磷酸盐，这将防止载体在分子内反应中循环化。通常使用细菌碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶进行此反应。虽然这种处理消除了分子内反应，但它的缺点是它需要合成插入物的亲缘关系。
酶法去除载体末端的 5 ′ 5 ′ 5^(')5^{\prime} 磷酸盐也很常见，这将防止载体在分子内反应中环化。这种反应通常使用细菌碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶。虽然这种处理方法可以消除分子内反应，但它的缺点是需要对合成插入物进行基因转化。无需修饰即可将 PCR 片段直接连接到载体中要简单得多。在该反应中，载体和插入片段的比率和浓度都很重要。如果浓度太低，则线性化载体将被连接到没有插入片段的环状质粒中。
通常使用细菌碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶进行此反应。虽然这种处理消除了分子内反应，但它的缺点是它需要合成插入物的亲缘关系。无需修饰即可将 pcr 片段直接连接到载体中要简单得多。在该反应中，载体和插入片段的比率和浓度都很重要。
使用不含钠的连接缓冲液也很重要，它显着抑制 T4 连接酶的平末端连接活性。
使用不含钠的连接缓冲液也很重要，因为钠会严重抑制 T4 连接酶的钝端连接活性。由于平末端连接不如粘性末端连接有效，因此感受态细胞的转化效率是一个重要因素。必须小心确保尽可能高的转换效率
使用不含钠的连接缓冲液也很重要，它显着抑制 T4 连接酶的平末端连接活性。由于平末端连接不如粘性末端连接有效，因此感受态细胞的转化效率是一个重要因素。必须小心确保尽可能高的转化效率
。  可能。
在某些情况下，平末端连接可能会失败，因为 PCR 产物不是平末端的。这个问题可以通过使用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段“抛光”末端来克服。这可以通过采取以下步骤轻松完成：（a） 扩增后，在沸水浴中加热 PCR 反应混合物 10 分钟（此步骤使 Taq 聚合酶失活）;（b） 调整 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+}浓度至 10 mM;© 添加 2 单位的 Klenow 片段;（d） 在室温下孵育 30 分钟。
在某些情况下，平末端连接可能会失败，因为 PCR 产物不是平末端的。这个问题可以通过使用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段 "抛光 "末端来克服。这可以通过采取以下步骤轻松完成：（a）扩增后，在沸水浴中加热 PCR 反应混合物 10 分钟（此步骤使 Taq 聚合酶失活）;（b）。扩增后，在沸水浴中加热 PCR 反应混合物 10 分钟（此步骤使 Taq 聚合酶失活）;（b）调整 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+} .调整 Mg 2 + Mg 2 + Mg^(2+)\mathrm{Mg}^{2+} 浓度至 10 mM;© 添加 2 单位的 Klenow 片段;（d） 在室温下孵育 30 分钟在室温下孵育 30 分钟。

3. 平端结扎程序  3.平端结扎程序

（a） 剪切 1 μ g 1 μ g 1mug1 \mu \mathrm{~g}载体与合适的限制性内切酶（如 SmaI）形成平末端，它在 CCC 和 GGG 之间形成平末端。通过苯酚提取和从乙醇溶液中沉淀来纯化载体。重新挂起到 ∼ 10 μ g / ml ∼ 10 μ g / ml ∼10 mug//ml\sim 10 \mu \mathrm{~g} / \mathrm{ml}在 H 2 O H 2 O H_(2)O\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}. （b） 通过吸附到玻璃珠上或通过色谱柱方案（例如 Qiagen）纯化插入片段（PCR 片段）。这将去除扩增引物。通常不需要凝胶纯化。
.（b）通过吸附到玻璃珠上或通过色谱柱方案（例如 Qiagen）纯化插入片段（PCR 片段）。这将去除扩增引物。通常不需要凝胶纯化。
© 将 15 ng 载体和 250 ng PCR 反应产物干燥到底部
将 15 ng 载体和 250 ng PCR 反应产物干燥到底部 0.75 − ml 0.75 − ml 0.75-ml0.75-\mathrm{ml}微量离心管。 （d） 添加  微量离心管。添加 10 μ l 10 μ l 10 mul10 \mu \mathrm{l}的连接反应混合物。请勿混合。 （e） 孵育 6 小时至 10 月
的反应连接混合物。 请勿混合。孵育 6 小时至 10 月 17 ∘ C 17 ∘ C 17^(@)C17^{\circ} \mathrm{C}.
（a）剪切 1 μ g 1 μ g 1mug1 \mu \mathrm{~g} 载体与合适的限制性内切酶（如 SmaI）形成平末端，它在 CCC 和 GGG 之间形成平末端。通过苯酚提取和从乙醇溶液中沉淀来纯化载体。重新挂起到 ∼ 10 μ g / ml ∼ 10 μ g / ml ∼10 mug//ml\sim 10 \mu \mathrm{~g} / \mathrm{ml} 在 H 2 O H 2 O H_(2)O\mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.75 − ml 0.75 − ml 0.75-ml0.75-\mathrm{ml} 微量离心管。 （d）添加 10 μ l 10 μ l 10 mul10 \mu \mathrm{l} 17 ∘ C 17 ∘ C 17^(@)C17^{\circ} \mathrm{C} .添加 10 μ l 10 μ l 10 mul10 \mu \mathrm{l} 17 ∘ C 17 ∘ C 17^(@)C17^{\circ} \mathrm{C} .
对于 PCR 扩增的小亚基 rDNA，该程序在噬菌体 M13 载体中每 25 个非重组（蓝色）产生约 1 个重组噬菌斑（白色）。

（vi） 扩增基因的直接测序  （vi）扩增基因的直接测序

聚合酶链反应产物可以直接测序，从而避免了基因克隆的步骤 （Gyllensten， 1989）。除了简单之外，这种方法还避免了因 Taq 聚合酶错误掺入核苷酸而导致的错误（参见 E（i） 部分）。可以避免错误掺入的核苷酸，因为它们仅存在于一小部分产物分子中，因此在测序凝胶上不可见。例如，在最坏的情况下 - 用一个 tem 板分子引发的反应在第一轮复制中引入的误差 - 该误差将仅存在于 25 % 25 % 25%25 \%的产品分子。因此，直接测序是唯一有效的方法，适用于罕见突变会混淆数据的解释。
聚合酶链反应产物可以直接测序，从而避免了基因克隆的步骤 （Gyllensten， 1989）。除了简单之外，这种方法还避免了因 Taq 聚合酶错误掺入核苷酸而导致的错误（参见 E（i）部分）。部分）。可以避免错误掺入的核苷酸，因为它们仅存在于一小部分产品分子中，因此在测序凝胶上不可见。例如，在最坏的情况下 - 用一个 tem 板分子引发的反应在第一轮复制中引入的误差 - 该误差将仅存在于 25 % 25 % 25%25 \% 的产品分子。因此，直接测序是唯一有效的方法，适用于罕见突变会混淆数据的解释。
尽管双链 PCR 产物可以作为直接测序的模板（Wrischnik等人，1987 年;Wong et al.， 1987;Saiki等人，1988b），它们通常不会产生从双链质粒或单链DNA分子的测序中获得的那么多的可用序列信息（Engelke等人，1988;Gyllensten 和 Erlich，1988 年;Stoflet et al.， 1988;Higuchi 和 Ochman，1989 年;Mitchell 和 Merrill，1989 年）。这显然是由于线性双链模板的快速再结合引起的，其中排除了测序引物。拓扑约束显然起到了减慢变性质粒 DNA 的重新结合的作用，因此使其比线性双链模板更容易测序。
尽管双链 PCR 产物可以作为直接测序的模板（Wrischnik 等人，1987 年；Wong et al.，1987 年；Saiki 等人，1988 年），它们通常不会产生从双链质粒或单链 DNA 分子的测序中获得的那么多的可用序列信息（Engelke 等人，1988 年；Gyllensten 和 Erlich，1988 年；Stoflet et al.拓扑约束显然起到了减慢变性质粒 DNA 的重新结合的作用，因此使其比线性双链模板更容易测序。
单链 DNA 产物可以使用“不对称引发”方法通过聚合酶链反应合成。在“不对称引物”中，其中一个寡核苷酸引物的浓度显著降低，结果是该引物在早期复制周期中耗尽。在仅存在一种引物的情况下，扩增将不再呈指数级进行。相反，单链副本将由过量提供的引物制成。
单链 DNA 产物可以使用 "不对称引发 "方法通过聚合酶链反应合成。在 "不对称引物 "中，其中一个寡核苷酸引物的浓度显著降低，结果是该引物在早期复制周期中耗尽。在仅存在一种引物的情况下，扩增将不再呈指数级进行。相反，单链副本将由过量提供的引物制成。
100：1 的引物比例通常提供良好的结果。重要的是限制性引物的浓度不能过高;否则，反应底物将在限制性引物耗尽之前耗尽，并且不会形成单链产物。反应开始时应存在约 0.5 pmole 的限制性引物。
对于长度超过约 1 kb 碱基的序列，不对称引物效率低下。引物可以构建以扩增和直接测序较长的基因，将其作为一系列较短的重叠片段进行测序。 Stoflet 及其同事 （1988） 描述了一种产生单链 DNA 的替代方法。他们将噬菌体启动子连接到一个 PCR 引物上，并通过转录扩增产物产生单链 RNA 拷贝。然后使用逆转录酶对 RNA 进行测序。这种方法虽然有效，但在扩增后涉及一个额外的酶促步骤。可能是因为它的复杂性，这种方法还没有得到广泛使用。
对于长度超过约 1 kb 碱基的序列，不对称引物效率低下。引物可以构建以扩增和直接测序较长的基因，将其作为一系列较短的重叠片段进行测序。 Stoflet 及其同事 （1988）描述了一种产生单链 dna 的替代方法。他们将噬菌体启动子连接到一个 pcr 引物上，并通过转录扩增产物产生单链 rna 拷贝。描述了一种产生单链 DNA 的替代方法。他们将噬菌体启动子连接到一个 PCR 引物上，并通过转录扩增产物产生单链 RNA 拷贝。然后使用逆转录酶对 RNA 进行测序。这种方法虽然有效，但在扩增后涉及一个额外的酶促步骤。可能是因为它的复杂性，这种方法还没有得到广泛使用。
Mitchell 和 Merrill （1989） 描述了一种通过亲和层析从 PCR 反应中生成单链 DNA 的技术。使用一种生物素连接的引物扩增 DNA。所得 PCR 产物可与链霉亲和素连接的琼脂糖结合;然而，在碱性变性条件下，只有从琼脂糖中洗脱从缺乏生物素部分的扩增引物合成的 DNA 链。链霉亲和素-生物素相互作用的可靠性表明，该技术最终可能会取代其他技术，成为从 PCR 反应中分离和制备单链 DNA 模板的首选方法。
Mitchell 和 Merrill （1989） 描述了一种通过亲和层析从 pcr 反应中生成单链 dna 的技术。描述了一种通过亲和层析从 pcr 反应中生成单链 dna 的技术。使用一种生物素连接的引物扩增 dna。所得 pcr 产物可与链霉亲和素连接的琼脂糖结合;然而，在碱性变性条件下，只有从琼脂糖中洗脱从缺乏生物素部分的扩引物合成的 dna 链。链霉亲和素-生物素相互作用的可靠性表明，该技术最终可能会取代其他技术，成为从 pcr 反应中分离和制备单链 dna 模板的首选方法。

（vii） 扩增基因的限制性分析  （vii） 扩增基因的限制性分析扩增基因的限制性分析

PCR 产物的限制性片段长度多态性 （RFLP） 提供了一种区分同源基因的快速方法。这种方法提供的信息比测序少得多，并且可应用于数据的系统发育分析类型存在限制，但该方法的相对速度使其适用于需要快速比较许多不同基因拷贝的场合。图 7.8 显示了使用 PCR 筛选从天然微生物种群中分离的 16 个 S rDNA 克隆的示例。在这种情况下，RFLP 用于对克隆进行排序和鉴定，以便可以通过测序进一步表征独特的克隆。
pcr 产物的限制性片段长度多态性 （rflp）提供了一种区分同源基因的快速方法。这种方法提供的信息比测序少得多，并且可应用于数据的系统发育分析类型存在限制，但该方法的相对速度使其适用于需要快速比较许多不同基因拷贝的场合。图 7.8 显示了使用 PCR 筛选从天然微生物种群中分离的 16 个 S rDNA 克隆的示例。在这种情况下，RFLP 用于对克隆进行排序和鉴定，以便可以通过测序进一步表征独特的克隆。
如果扩增的 DNA 主要来自单个基因，则 PCR 产物可以直接用限制性核酸内切酶消化。这种方法非常简单;扩增产物只是
图 7.8 使用限制性片段长度多态性对来自天然微浮游生物种群的克隆 16 个 S rRNA 基因进行排序和分析。从马尾藻海微浮游生物基因组 DNA 中扩增基因，并克隆到噬菌粒载体 Bluescript 中。A，1 千克碱基 DNA 分子量标准（Bethesda Research Laboratories）;B-J，含有克隆质粒的限制性内切物 16 S 16 S 16 S16 SrRNA 基因。K，无插入片段的线性化质粒。重组质粒用限制性核酸内切酶 BamHI 和 PstI 消化，它们在克隆基因两侧的位点切割，偶尔在基因内切割。凝胶组成为 0.75 % 0.75 % 0.75%0.75 \%西肯姆， 0.75 % 0.75 % 0.75%0.75 \%NuSieve 琼脂糖。通过加入 0.1 体积的 2 M 乙酸钠和 2 体积的乙醇沉淀，并重悬于适合限制性内切酶消化的缓冲液中。
酶消化后，限制性片段可以在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上显示。

（viii） PCR 作为定量检测  （viii） 作为定量检测PCR 作为定量检测

很容易设想 PCR 可能用作环境或临床样本中特定基因的检测的应用。在需要定性信息的情况下（换句话说，基因是否存在），PCR 提供了一种非常灵敏的方法。然而，使 PCR 非常敏感的相同属性可能会给定量检测的开发带来问题。如下所述，这个问题可以通过在 PCR 反应中加入内标来规避（Gilliland等人，1990 年;Wang 和 Mark，1990 年）。
很容易设想 PCR 可能用作环境或临床样本中特定基因的检测的应用。在需要定性信息的情况下（换句话说，基因是否存在），PCR 提供了一种非常灵敏的方法。然而，使 PCR 非常敏感的相同属性可能会给定量检测的开发带来问题。如下所述，这个问题可以通过在 PCR 反应中加入内标来规避（Gilliland 等人，1990 年；Wang 和 Mark，1990 年）。
为了说明这一点，假设使用 PCR 来尝试定量确定一系列环境样本中 NIF 基因的相对数量。假设所有反应条件（包括模板浓度）都保持不变，NIF 基因 PCR 产物的量是否反映了原始样品中 NIF 基因的量？在实践中，任何影响
为了说明这一点，假设使用 pcr 来尝试定量确定一系列环境样本中 nif 基因的相对数量。假设所有反应条件（包括模板浓度）都保持不变，nif 基因 pcr 产物的量是否反映了原始样品中 nif 基因的量？ 在实践中，任何影响 I I II，由于方程 （1），延伸反应的效率将使结果无法解释。例如，对于 30 轮扩增，导致 I 降低 5% 的抑制剂将导致 79 % 79 % 79%79 \%降低 N N NN、产品的数量。这些问题可以通过在 PCR 反应中加入内标来克服。理想情况下，标准品是与扩增引物的结合位点匹配的模板 DNA，但其中间序列与靶标的序列不同。然后可以使用扩增的靶产物与扩增的对照模板产物的比率来比较样品中靶基因的相对丰度（Choi等人，1989;Wang 和 Mark，1990 年）。
这些问题可以通过在 PCR 反应中加入内标来克服。理想情况下，标准品是与扩增引物的结合位点匹配的模板 DNA，但其中间序列与靶标的序列不同。然后可以使用扩增的靶产物与扩增的对照模板产物的比率来比较样品中靶基因的相对丰度（Choi 等人，1989;Wang 和 Mark，1990 年）。
之间的非线性关系 I I II和 N N NN还会影响引物与混合样品中相关模板可能存在差异结合的应用。其影响可以是积极的，也可以是消极的，具体取决于实验策略，如以下示例所示。假设 PCR 用于从混合细菌种群中扩增真细菌的 16 个 S rRNA 基因，以便为微生物群落的不可培养成员提供遗传标记。混合样品中不同种类的引物靶结构域的微小变化会产生什么影响？答案是，给定 16S rRNA PCR 产物的相对丰度几乎肯定不会定量反映混合样品中物种的实际丰度。通过以低严格性进行杂交，可以最大限度地减少这种偏差的影响。偏差并不妨碍使用扩增进行样本之间的相对比较或分离遗传标记。关于这些限制，应该注意的是，其他克隆方法（例如 shotgun 克隆方法）也可能使克隆表示产生偏差，但也具有进一步的缺点，例如连接反应的要求，以及方案的总体费用和复杂性。
其影响可以是积极的，也可以是消极的，具体取决于实验策略，如以下示例所示。假设 PCR 用于从混合细菌种群中扩增真细菌的 16 个 S rRNA 基因，以便为微生物群落的不可培养成员提供遗传标记。混合样品中不同种类的引物靶结构域的微小变化会产生什么影响？ 答案是，给定 16S rRNA PCR 产物的相对丰度几乎肯定不会定量反映混合样品中物种的实际丰度。通过以低严格性进行杂交，可以最大限度地减少这种偏差的影响。关于这些限制，应该注意的是，其他克隆方法（例如 shotgun 克隆方法）也可能使克隆表示产生偏差，但也具有进一步的缺点，例如连接反应的要求，以及方案的总体费用和复杂性。

E. 使用 PCR 的误差来源
E.使用 PCR 的误差来源

（i） Taq 聚合酶读数错误  （i）Taq 聚合酶读数错误

在克隆和测序 PCR 产物时，碱基掺入错误导致的复制错误可能是一个令人担忧的问题。Innis 等人 （1988） 报告了 35 个 PCR 循环后，4000 至 5000 个碱基对的错误率为 1 个。Dunning 等人（1988 年）报告了 8000 个核苷酸测序中的 22 个可能错误——每 364 个核苷酸中有一个错误（ 0.3 % 0.3 % 0.3%0.3 \%).Innis 等人认为，错误掺入会促进链终止，从而减弱缺陷分子的扩增。
在克隆和测序 PCR 产物时，碱基掺入错误导致的复制错误可能是一个令人担忧的问题。Innis 等人（1988 年）报告了 35 个 PCR 循环后，4000 至 5000 个碱基对的错误率为 1 个。报告了 35 个 PCR 循环后，4000 至 5000 个碱基对的错误率为 1 个。Dunning 等人（1988 年）报告了 8000 个核苷酸测序中的 22 个可能错误--每 364 个核苷酸中有一个错误（ 0.3 % 0.3 % 0.3%0.3 \% ).Innis 等人认为，错误掺入会促进链终止，从而减弱缺陷分子的扩增。
报告错误率的巨大差异可能反映了对尚未充分探索的反应条件的依赖性。由于重复复制的简单加性效应，可以预期误差会随着扩增轮次的增加而线性增加。在某些情况下，在复制的晚期循环中核苷酸底物的耗竭可能会导致错误率增加。
PCR 伪影对微生物系统学研究有什么影响？与观察到的微生物物种之间的相似性相比，报告的最高错误率 （0.0025） 可以忽略不计。因此，Taq 聚合酶碱基掺入错误不太可能导致系统发育推断错误。
pcr 伪影对微生物系统学研究有什么影响？ 与观察到的微生物物种之间的相似性相比，报告的最高错误率 （0.0025）。可以忽略不计。因此，Taq 聚合酶碱基掺入错误不太可能导致系统发育推断错误。
来自许多嗜热细菌的 DNA 聚合酶已被报道并部分表征。有充分的理由乐观地认为，引入替代热稳定酶将减少 PCR 技术目前的一些局限性。

（ii） 嵌合基因产品  （ii） 嵌合基因产品嵌合基因产品

使用 PCR 扩增来自同源基因混合种群（例如混合微生物种群 DNA 中的 rRNA 基因）的基因的一个考虑因素是担心可能产生嵌合扩增产物。嵌合产物的形成可以通过一些模板在引物延伸期间未完全复制的机制发生。在随后的循环中，部分拷贝可以重新退火到相关的同系物，以便在第二个模板上进一步扩展。结果将是创建包含从不同同源物复制的区域的嵌合基因。 Shuldiner 等人 （1989） 报道了一个案例，其中明显的嵌合胰岛素前体基因被克隆为 PCR 的伪影，但到目前为止我们还没有观察到嵌合产物的例子。我们的实验室已经克隆了
使用PCR 扩增来自同源基因混合种群（例如混合微生物种群 DNA 中的rRNA 基因）的基因的一个考虑因素是担心可能产生嵌合扩增产物。嵌合产物的形成可以通过一些模板在引物延伸期间未完全复制的机制发生。 在随后的循环中，部分拷贝可以重新退火到相关的同系物，以便在第二个模板上进一步扩展。 结果将是创建包含从不同同源物复制的区域的嵌合基因。报道了一个案例，其中明显的嵌合胰岛素前体基因被克隆为 pcr 的伪影，但到目前为止我们还没有观察到嵌合产物的例子。
16 S 16 S 16 S16 S使用 PCR 从天然微浮游生物种群中获取 rRNA 基因。我们研究的克隆基因分为两个不相关的系统发育组。嵌合基因产物可能看起来介于两组之间。没有检测到这样的 “杂交种”。此外，嵌合基因可能被认为违反了高度保守的二级结构 16 S 16 S 16 S16 SrRNA，它由代偿性突变维持。没有发现这种违反二级结构的行为。相反，对一级序列、点图和二级结构的分析表明，嵌合基因不在我们研究的克隆中（图 7.4）。
16 S 16 S 16 S16 S 使用 PCR 从天然微浮游生物种群中获取 rRNA 基因。我们研究的克隆基因分为两个不相关的系统发育组。"杂交种"。此外，嵌合基因可能被认为违反了高度保守的二级结构 16 S 16 S 16 S16 S rRNA，它由代偿性突变维持。没有发现这种违反二级结构的行为。相反，对一级序列、点图和二级结构的分析表明，嵌合基因不在我们研究的克隆中（图 7.4）。
Innis 等人 （1988） 报道 Taq 聚合酶具有很强的合成能力。在存在足够 dNTP 底物的情况下，过早终止是罕见的事件。这表明嵌合基因，如错误掺入的核苷酸，可能是晚期 dNTP 底物浓度低的结果。因此，我们建议限制扩增循环的数量，使其不超过 25 % 25 % 25%25 \%最初存在的底物核苷酸被掺入。请注意，表 7.1 中列出的条件足以合成 26 μ g 26 μ g 26 mug26 \mu \mathrm{~g}的 DNA，假设碱基以等摩尔浓度存在于模板序列中。
Innis 等人 （1988）报道 Taq 聚合酶具有很强的合成能力。在存在足够 dNTP 底物的情况下，过早终止是罕见的事件。这表明嵌合基因，如错误掺入的核苷酸，可能是晚期 dNTP 底物浓度低的结果。因此，我们建议限制扩增循环的数量，使其不超过 25 % 25 % 25%25 \% 最初存在的底物核苷酸被掺入。请注意，表 7.1 中列出的条件足以合成 26 μ g 26 μ g 26 mug26 \mu \mathrm{~g} 的 DNA，假设碱基以等摩尔浓度存在于模板序列中。

（iii） 污染  （iii）污染

在使用 PCR 作为基因存在的测试的情况下，污染会造成严重的问题（Lo et al.， 1988;Kwok 和 Higuchi，1989 年）。示例包括 PCR 的诊断用途，例如检测临床标本中的病毒或细菌基因，以及检测生物体中的基因。的敏感性 P C R P C R PCRP C R甚至允许检测单个基因拷贝。因此，玻璃器皿、试剂或移液装置的轻微污染很容易导致假阳性的形成。这些问题使基因检测成为 PCR 最具挑战性的用途之一。
在使用 PCR 作为基因存在的测试的情况下，污染会造成严重的问题（Lo et al.1988；Kwok 和 Higuchi，1989 年）。示例包括 PCR 的诊断用途，例如检测临床标本中的病毒或细菌基因，以及检测生物体中的基因。的敏感性 P C R P C R PCRP C R 甚至允许检测单个基因拷贝。因此，玻璃器皿、试剂或移液装置的轻微污染很容易导致假阳性的形成。这些问题使基因检测成为 PCR 最具挑战性的用途之一。
污染问题要求严格清洁和仔细控制。PCR 工作最好在与常规操作靶基因的实验室部分物理隔离的情况下进行。试剂、玻璃器皿和移液装置应分开存放。带有一次性吸头和柱塞的外置活塞式移液装置可防止吸入移液器的遗传物质污染。

确认

我感谢我的同事 Theresa Britschgi、Volker Huss 和 Nathan Wood 提供文中所示的 PCR 示例。我还要感谢 Katharine Field 对手稿的批判性评价。这项工作得到了美国国家科学基金会对 SJG 和俄勒冈农业实验站的 BSR-8818167 资助的部分支持，其中技术报告编号为 9056。
这项工作得到了美国国家科学基金会对 SJG 和俄勒冈农业实验站的 BSR-8818167 资助的部分支持，其中技术报告编号为 9056。

F. 参考资料  F.参考资料

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核酸探针的开发与应用

David A. Stahl 和 Rudolf Amann伊利诺伊大学兽医病理生物学系，2001 South Lincoln Avenue， Urbana， IL 61801， USA
伊利诺伊大学兽医病理生物学系，2001 South Lincoln Avenue，Urbana， IL 61801， USA

A. 引言  A.引言

本章的必要介绍以免责声明的形式提供：（到目前为止）还没有单一的途径来设计确定性核酸探针。尽管核酸杂交的首次应用是在 1960 年代初期描述的（Marmur 和 Lane，1960 年;Hall 和 Spiegelman，1961 年），但在过去十年中，基本的经验和理论框架几乎没有变化。探针设计通常是经验性的或“裤子的座位”。一种常见的方法是随机筛选重组文库以查找所需特异性的探针。条件仅针对给定研究的必要程度进行优化。核酸探针的应用在很大程度上仍然是一门由即时需求驱动的艺术。杂交通常在非常广泛的条件下进行良好。然而，与常规实验室核酸操作通常所需的相比，使用细菌系统所需的确定性杂交对特异性和敏感性提出了更高的要求。本章介绍后一种需求。
本章的必要介绍以免责声明的形式提供：（到目前为止）还没有单一的途径来设计确定性核酸探针。尽管核酸杂交的首次应用是在 1960 年代初期描述的（Marmur 和 Lane，1960 年；Hall 和 Spiegelman，1961一种常见的方法是随机筛选重组文库以查找所需特异性的探针。条件仅针对给定研究的必要程度进行优化。核酸探针的应用在很大程度上仍然是一门由即时需求驱动的艺术。
Another aspect of nucleic acid probe technology concerns detection systems. Although all early studies used (and most contemporary studies still use) radioactive probes, concerns of safety and versatility have fostered the development of a variety of non-radioactive detection systems. These techniques are essential adjuncts to hybridization. However, it would require an entire volume to describe and properly elaborate upon the various existing and evolving approaches for the detection of nucleic acid hybrids; certainly beyond the scope of a single chapter. As a com-
核酸探针技术的另一个方面涉及检测系统。虽然所有早期研究都使用（而且大多数当代研究仍在使用）放射性探针，但对安全性和多功能性的关注促进了各种非放射性检测系统的发展。这些技术是杂交的重要辅助手段。然而，要描述并适当阐述现有的和不断发展的各种核酸杂交检测方法，需要整整一卷书的篇幅；当然，这也超出了一章的范围。作为一
© 1991 John Wiley & Sons Ltd.
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promise, we have tabulated and commented upon those non-radioactive detection systems that have received widespread use. Those techniques now in common use are described in experimental detail. The primary focus of this chapter is probe design and establishing appropriate conditions of hybridization.
在此，我们列举并评述了那些得到广泛应用的非放射性检测系统。本章将对目前普遍使用的技术进行详细的实验描述。本章的主要重点是探针设计和建立适当的杂交条件。
The chapter therefore begins with a brief ‘nuts and bolts’ coverage of important theoretical and experimental considerations. These include working definitions of important parameters (e.g. stringency, specificity T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} and T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} ) and the influence of reaction conditions (e.g. ionic strength, temperature) on them. Although much remains empirical, the introduction provides a useful starting point for optimization of specific hybridization reactions. The use of both DNA and RNA probes is described in detail, emphasizing experimental techniques of accepted general utility. Less tried or evolving approaches to probe fabrication will be addressed in tabular form. Since the emphasis of the book is upon determinative microbiology, the later portion of the chapter will focus on the use of the ribosomal RNAs as targets for nucleic acid probes. The use of the ribosomal RNAs for determinative and phylogenetic studies, as evidenced by other chapters in this volume, is now a well-accepted and powerful tool for determinative studies. The rRNA-based analyses are applicable to both extracted nucleic acid and whole cell hybridization. The latter has made possible the application of the extensive 16 S rRNA database to determinative fluorescence microscopy.
因此，本章首先简要介绍了重要的理论和实验注意事项。其中包括重要参数（如严格性、特异性 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 和 T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} ）的工作定义以及反应条件（如离子强度、温度）对它们的影响。尽管许多内容仍是经验之谈，但该介绍为优化特异性杂交反应提供了一个有用的起点。该书详细介绍了 DNA 和 RNA 探针的使用，强调了公认的通用实验技术。至于尝试较少或不断发展的探针制作方法，将以表格的形式加以说明。由于本书的重点是确定性微生物学，因此本章后半部分将重点介绍核糖体 RNA 作为核酸探针靶标的使用。核糖体 RNA 用于定性和系统发育研究，正如本卷其他章节所证明的那样，现已成为定性研究中公认的强大工具。基于 rRNA 的分析适用于提取核酸和全细胞杂交。后者使广泛的 16 S rRNA 数据库在确定性荧光显微镜中的应用成为可能。

B. GENERAL CONSIDERATIONS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION
B.核酸杂交的一般注意事项

The use of determinative nucleic acid hybridization (nucleic acid probes) must take into account the characteristic features of formation and breakdown of a specific double-helix. Most important is the balance between specificity of the reaction and detection of reaction product. The latter is largely dependent upon the detection system used (see below). Specificity and sensitivity are usually competing entities and must be balanced according to the determinative requirements. As an introduction to the applied sections, an overview of fundamental and practical aspects of nucleic acid hybridization is offered. The following is a collection of common terms and definitions applied to studies and descriptions of hybridization reactions (adapted from Lathe, 1985).
使用确定性核酸杂交（核酸探针）必须考虑到特定双螺旋形成和分解的特征。最重要的是在反应的特异性和反应产物的检测之间取得平衡。后者在很大程度上取决于所使用的检测系统（见下文）。特异性和灵敏度通常是相互竞争的，必须根据决定性要求加以平衡。作为应用部分的引言，本文概述了核酸杂交的基本和实用方面。以下是应用于杂交反应研究和描述的常用术语和定义集（改编自 Lathe, 1985）。
Complement. With reference to the Watson-Crick canonical base pairs, A pairs with T (or U ) and G pairs with C . The canonical base pairs are also referred to as complementary or as complements of each other (i.e. A is complementary to T).
互补。关于沃森-克里克碱基对，A 与 T（或 U）成对，G 与 C 成对。典型碱基对也被称为互补碱基对或互补碱基对（如 A 与 T 互补）。
Probe. A single strand of DNA or RNA, intended to hybridize with a complementary sequence (e.g. the coding sequence for a particular protein or stable RNA) in order to detect that sequence. Probes are synthesized both enzymatically and chemically (see below).
探针。DNA 或 RNA 单链，用于与互补序列（如特定蛋白质或稳定 RNA 的编码序列）杂交，以检测该序列。探针可通过酶法和化学法合成（见下文）。
Target. The target sequence for a probe is the complementary sequence to which the probe is designed to hybridize.
目标。探针的靶序列是指探针与之杂交的互补序列。
Match. ‘Match’ is generally used to refer to canonical pairing between probe and target at a specified position. ‘Match’ is also used to describe complete complementarity between probe and target sequences.
匹配。匹配 "一般指探针和目标物在指定位置上的典型配对。匹配 "也用于描述探针和目标序列之间的完全互补性。
Mismatch. A mismatch at a particular position occurs when the nucleotide in the probe does not complement the nucleotide at the same position in the target sequence (non-canonical pair).
错配。当探针中的核苷酸与目标序列中同一位置的核苷酸不互补（非经典配对）时，就会出现特定位置的错配。
Homology. The percentage homology ( h h hh ) between two sequences of identical length ( n n nn ) and containing a given number of mismatches ( m m mm ) is given by the expression h = 100 ( n − m ) / n h = 100 ( n − m ) / n h=100(n-m)//nh=100(n-m) / n. Similarity is now considered the semantically correct term for this value. However, for the purposes of this chapter the terms homology and similarity are used interchangeably.
同源性。两个长度相同（ n n nn ）且包含一定数量错配（ m m mm ）的序列之间的同源性百分比（ h h hh ）由表达式 h = 100 ( n − m ) / n h = 100 ( n − m ) / n h=100(n-m)//nh=100(n-m) / n 给出。相似性现在被认为是该值在语义上的正确术语。不过，在本章中，同源性和相似性这两个术语可以互换使用。
Stringency. Stringency describes the conditions of hybridization or the hybridization wash step. The greater the stringency of the hybridization or subsequent wash step (see below), the fewer, if any, mismatches remain in the duplex structure.
严格度。严格程度是指杂交或杂交洗涤步骤的条件。杂交或后续清洗步骤（见下文）的严格程度越高，双链结构中残留的错配（如果有的话）就越少。
Oligonucleotide. A short single strand of DNA (oligodeoxyribonucleotide) usually 6-50 nucleotides in length.
寡核苷酸。通常长度为 6-50 个核苷酸的 DNA 短单链（寡脱氧核苷酸）。
Duplex structure. Double-helix structure composed of antiparallel strands of DNA-DNA, DNA-RNA or RNA-RNA held in association by specific hydrogen bonding between the nucleotides comprising each strand.
双链结构。由 DNA-DNA、DNA-RNA 或 RNA-RNA 的反平行链组成的双螺旋结构，每条链上的核苷酸之间通过特定的氢键结合在一起。

(i) Melting point  (i) 熔点

For determinative studies the single most important feature defining a given double-helix structure is its melting point ( T m ) T m (T_(m))\left(T_{m}\right). In this respect, the double helix structure has been likened to a one-dimensional crystalline lattice (Marmur and Doty, 1959). The breakdown of the helix (or crystal) occurs at a specific melting temperature and propagation of the helix (or growth of the crystal) follows a nucleation event (formation of a seed crystal or short duplex structure). However, with the exception of homopolymers (e.g. poly U-poly A), the double-helix structure does not dissociate (melt) completely at a specific temperature. Rather, denaturation proceeds over a temperature range.
对于确定性研究而言，定义特定双螺旋结构的唯一最重要特征是其熔点 ( T m ) T m (T_(m))\left(T_{m}\right) 。在这方面，双螺旋结构被比作一维晶格（Marmur 和 Doty，1959 年）。螺旋体（或晶体）在特定的熔化温度下分解，螺旋体的传播（或晶体的生长）遵循成核事件（种子晶体或短双链结构的形成）。然而，除均聚物（如聚 U 聚 A）外，双螺旋结构不会在特定温度下完全解离（熔化）。相反，变性是在一定温度范围内进行的。
The T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} is defined as the temperature corresponding to the mid-point in the transition from helix to random coil (frequently measured optically by monitoring the characteristic hyperchromatic shift of denaturation). In addition, the temperature range over which transition from helix to
T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 被定义为从螺旋过渡到无规线圈的中点所对应的温度（通常通过监测变性的特征性高色移进行光学测量）。此外，从螺旋过渡到无规线圈的温度范围为
random coil occurs varies significantly, depending upon length, nucleotide composition and ionic strength. The zipping (renaturation) or unzipping (denaturation) of the helix is influenced by nucleotide composition in the vicinity of base-pair formation or denaturation (GC-rich versus AT-rich regions). This effect and its influence on the observed transition temperature is referred to as cooperativity. At low ionic strength local compositional differences are suggested to contribute to a broadening of the transition range (Dove and Davidson, 1962).
由于长度、核苷酸组成和离子强度的不同，随机螺旋的形成也有很大差异。螺旋的拉链（再饱和）或解压缩（变性）会受到碱基对形成或变性附近核苷酸组成（富含 GC 与富含 AT 的区域）的影响。这种效应及其对观察到的转变温度的影响被称为合作性。在低离子强度下，局部成分差异被认为有助于扩大转变范围（Dove 和 Davidson，1962 年）。

(ii) T m T m T_(m)T_{m} versus T d T d T_(d)T_{d} versus T w T w T_(w)T_{w}
(ii) T m T m T_(m)T_{m} 对 T d T d T_(d)T_{d} 对 T w T w T_(w)T_{w}

To this point, discussion has been restricted to long double-helix structures (greater than about 500 nucleotides in length). The temperature mid-point of the helix-to-random coil transition is the same for the formation or the breakdown of long duplexes. This is not true for oligonucleotides in duplex structure (e.g. bound to immobilized DNA). The dissociation temperatures T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} of short oligonucleotide hybrids, unlike longer complementary structures, is concentration dependent. Thus, under non-equilibrium conditions (such as temperature-dependent dissociation of membrane-bound probe) the observed mid-point in dissociation may be lower than a more thermodynamically rigorous determination of T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}}. Another practical convention is the use of T w T w T_(w)T_{w}. This refers to the optimal temperature for washing at a specified monovalent cation concentration. In practice the T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} (or T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} ) and T w T w T_(w)T_{w} are frequently treated as equivalent.
到目前为止，讨论仅限于长双螺旋结构（长度超过约 500 个核苷酸）。从螺旋到随机线圈转变的温度中点对于长双链的形成或分解都是相同的。但双链结构中的寡核苷酸（如与固定 DNA 结合）则不然。与较长的互补结构不同，短寡核苷酸杂交体的解离温度 T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} 与浓度有关。因此，在非平衡条件下（如膜结合探针的解离与温度有关），观察到的解离中点可能低于更严格的热力学测定 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 。另一个实用惯例是使用 T w T w T_(w)T_{w} 。这是指在特定单价阳离子浓度下的最佳洗涤温度。在实践中， T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} （或 T d T d T_(d)T_{\mathrm{d}} ）和 T w T w T_(w)T_{w} 经常被视为等价物。

(iii) Estimation of T m T m T_(m)T_{m}
(iii) T m T m T_(m)T_{m} 的估算

1. DNA probes of greater than 50 nucleotides
1.超过 50 个核苷酸的 DNA 探针

The basic parameters for estimating the T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} of a given double-helix structure were established in the early 1960s and 1970s. Empirical relationships describing their contributions to T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} are summarized below. These relationships were derived from relatively large double-helix structures and so are of less value in predicting the behavior of short duplexes. However, slight modifications offer reasonable approximations of shorter duplex structure stability (see below). The following provides the reader with a rationalization for the equations used for estimating T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} and also a better feeling for the relative importance of those parameters that are routinely adjusted in nucleic acid hybridization reactions.
用于估算给定双螺旋结构的 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 的基本参数是在 20 世纪 60 年代初和 70 年代确立的。下文总结了描述它们对 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 贡献的经验关系。这些关系是从相对较大的双螺旋结构中推导出来的，因此对预测短双链的行为价值较低。不过，稍加修改就可以合理地近似预测较短双链结构的稳定性（见下文）。以下内容为读者提供了估算 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 所用方程的合理性，同时也让读者更好地了解核酸杂交反应中常规调整参数的相对重要性。
Ionic strength. The T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} (in degrees Celsius) of DNA increases linearly with the logarithm of the ionic strength and is independent of the base ratio of the DNA (Dove and Davidson, 1962; Schildkraut and Lifson, 1965):
离子强度。DNA 的 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} （摄氏度）随离子强度的对数线性增加，与 DNA 的碱基比率无关（Dove 和 Davidson，1962 年；Schildkraut 和 Lifson，1965 年）：
T m , 2 = T m , 1 + 16.6 log ⁡ ( M 2 / M 1 ) T m , 2 = T m , 1 + 16.6 log ⁡ M 2 / M 1 T_(m,2)=T_(m,1)+16.6 log(M_(2)//M_(1))T_{\mathrm{m}, 2}=T_{\mathrm{m}, 1}+16.6 \log \left(M_{2} / M_{1}\right)
where M 1 M 1 M_(1)M_{1} and M 2 M 2 M_(2)M_{2} are the respective ionic strengths of the two solutions.
其中 M 1 M 1 M_(1)M_{1} 和 M 2 M 2 M_(2)M_{2} 分别是两种溶液的离子强度。
G + C G + C G+CG+C content. The effect of base composition on the thermal denaturation of DNA was early observed and has served as the basis for determining the % ( G + C ) % ( G + C ) %(G+C)\%(\mathrm{G}+\mathrm{C}) content of microorganisms (Marmur and Doty, 1959):
G + C G + C G+CG+C 含量。人们很早就观察到碱基组成对 DNA 热变性的影响，并以此为基础确定微生物的 % ( G + C ) % ( G + C ) %(G+C)\%(\mathrm{G}+\mathrm{C}) 含量（Marmur 和 Doty，1959 年）：
T m = 69.3 + 0.41 [ % ( G + C ) ] T m = 69.3 + 0.41 [ % ( G + C ) ] T_(m)=69.3+0.41[%(G+C)]T_{\mathrm{m}}=69.3+0.41[\%(\mathrm{G}+\mathrm{C})]
The above relationship was derived for solutions of DNA in 1 × 1 × 1xx1 \times SSC (standard saline citrate (SSC) contains 0.15 M sodium chloride and 0.015 M trisodium citrate).
上述关系是针对 DNA 在 1 × 1 × 1xx1 \times SSC（标准柠檬酸盐（SSC）含有 0.15 M 氯化钠和 0.015 M 柠檬酸三钠）中的溶液得出的。
The first equation combining the observed dependence of T m T m T_(m)T_{m} on both the salt concentration ( M ) ( M ) (M)(M) and the % ( G + C ) % ( G + C ) %(G+C)\%(G+C) was formulated by Schildkraut and Lifson (1965):
Schildkraut 和 Lifson（1965 年）提出了第一个方程，将观察到的 T m T m T_(m)T_{m} 对盐浓度 ( M ) ( M ) (M)(M) 和 % ( G + C ) % ( G + C ) %(G+C)\%(G+C) 的依赖性结合起来：
T m = 81.5 + 16.6 log ⁡ M + 0.41 [ % ( G + C ) ] T m = 81.5 + 16.6 log ⁡ M + 0.41 [ % ( G + C ) ] T_(m)=81.5+16.6 log M+0.41[%(G+C)]T_{\mathrm{m}}=81.5+16.6 \log M+0.41[\%(\mathrm{G}+\mathrm{C})]
Percentage of mismatched base pairs. A 1 % 1 % 1%1 \% base pairing mismatch corresponds to about a 1 − 1.5 ∘ C 1 − 1.5 ∘ C 1-1.5^(@)C1-1.5^{\circ} \mathrm{C} decrease in T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} (Bonner et al., 1973; Ausubel et al., 1987). The rate of DNA reassociation is approximately halved (at the optimum temperature for reassociation) for every 10 ∘ C 10 ∘ C 10^(@)C10^{\circ} \mathrm{C} reduction in T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} (Bonner et al., 1973).
错配碱基对的百分比。 1 % 1 % 1%1 \% 碱基配对错配大约相当于 T m T m T_(m)T_{\mathrm{m}} 减少 1 − 1.5 ∘ C 1 − 1.5 ∘ C 1-1.5^(@)C1-1.5^{\circ} \mathrm{C}