限制性酶切位点被设计成的扩增引物可用于将限制性核酸内切酶识别位点引入扩增基因的末端(Scharf et al., 1986)。Medlin 等人 (1988) 扩增引物中的限制性位点可用于在扩增基因的末端引入限制性内切酶识别位点(Scharf 等人,1986 年)。Medlin 等人(1988 年 使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点,这允许使用强制克隆程序。强制克隆具有明显的优势,即载体的多接头在两个不同的识别位点被切割后,不能在分子内反应中重新连接到自身身上。因此,高比例的转化体将包含可预测方向的克隆 PCR 产物。 限制性酶切位点被设计成的扩增引物可用于将限制性核酸内切酶识别位点引入扩增基因的末端(Scharf et al.,1986)。Medlin 等人(1988)使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点,这允许使用强制克隆程序。使用这种方法从低等真核生物中克隆 18 个 S rRNA 基因。通常每个引物中都包含不同的限制性位点,这允许使用强制克隆程序。强制克隆具有明显的优势,即载体的多接头在两个不同的识别位点被切割后,不能在分子内反应中重新连接到自身身上。因此,高比例的转化体将包含可预测方向的克隆 PCR 产物。 “强制克隆”技术的缺点是扩增的基因可能在内部限制性位点被切割。如果内部限制性位点离末端足够远,则从电泳凝胶上的迁移率变化或两个条带的出现中可以明显看出内部切割。如果多个条带很明显,则可以克隆每个条带以获得完整的基因。 "强制克隆 "技术的缺点是扩增的基因可能在内部限制性位点被切割。如果内部限制性位点离末端足够远,则从电泳凝胶上的迁移率变化或两个条带的出现中可以明显看出内部切割。如果多个条带很明显,则可以克隆每个条带以获得完整的基因。
强制克隆技术的第二个缺点是,位于 DNA 分子末端附近的限制性位点与限制性核酸内切酶的反应效率不如内部位点。例如,HpaII 和 MnoI 需要至少一个碱基位于5^(')5^{\prime}裂解识别序列的结束 (Baumstark等人,1979)。 强制克隆技术的第二个缺点是,位于 DNA 分子末端附近的限制性位点与限制性核酸内切酶的反应效率不如内部位点。例如,HpaII 和 MnoI 需要至少一个碱基位于 5^(')5^{\prime} 末端的识别序列进行裂解(Baumstark 等人,1979 年)。由于涉及的长度变化很小,因此不能使用迁移率偏移直接监测末端限制性位点消化的效率。然而,在这些情况下,连接测定可用于确定消化效率。在该检测中,消化的 PCR 产物与标准 DNA(例如噬菌体 lambda DNA)的相容限制性内切物混合,并使用 T4 DNA 连接酶连接。如果存在适当的粘性末端,则扩增的 DNA 分子将转化为异质大小的高分子量连接产物。否则,扩增产物的迁移率将不受连接的影响。 裂解识别序列的结束 (Baumstark 等人,1979)。由于涉及的长度变化很小,因此不能使用迁移率偏移直接监测末端限制性位点消化的效率。然而,在这些情况下,连接测定可用于确定消化效率。在该检测中,消化的 PCR 产物与标准 DNA(例如噬菌体 lambda DNA)的相容限制性内切物混合,并使用 T4 DNA 连接酶。如果存在适当的粘性末端,则扩增的 DNA 分子将转化为异质大小的高分子量连接产物。 避免内部限制性位点困难的一种方法是将“罕见”限制性位点掺入引物中。不幸的是,只有一种合适的酶 Not I 可用。这种方法尚未被证明是可行的,因为它与平末端连接相比没有优势,并且在消化 Not I 位点时遇到了困难(Tom Schmidt,个人通信)。 避免内部限制性位点困难的一种方法是将 "罕见 "限制性位点掺入引物中。不幸的是,只有一种合适的酶 Not I 可用。这种方法尚未被证明是可行的,因为它与平末端连接相比没有优势,并且在消化 Not I 位点时遇到了困难(Tom Schmidt,个人通信)。
2. 平末端克隆技术 2.平末端克隆技术
平末端连接程序是目前克隆 PCR 反应产物最实用的方法。平淡的双链 DNA 分子5^(')5^{\prime}磷酸盐和 3' 羟基可以通过 T4 DNA 连接酶连接。该反应不如“粘性末端”连接有效,可能是因为底物的非共价氢键使“粘性末端”反应基本上是一级的。 平淡的双链 DNA 分子 5^(')5^{\prime} 磷酸盐和 3' 羟基可以通过 T4 DNA 连接酶连接。该反应不如 "粘性末端 "连接有效,可能是因为底物的非共价氢键使 "粘性末端 "反应基本上是一级的。
尽管双链 PCR 产物可以作为直接测序的模板(Wrischnik等人,1987 年;Wong et al., 1987;Saiki等人,1988b),它们通常不会产生从双链质粒或单链DNA分子的测序中获得的那么多的可用序列信息(Engelke等人,1988;Gyllensten 和 Erlich,1988 年;Stoflet et al., 1988;Higuchi 和 Ochman,1989 年;Mitchell 和 Merrill,1989 年)。这显然是由于线性双链模板的快速再结合引起的,其中排除了测序引物。拓扑约束显然起到了减慢变性质粒 DNA 的重新结合的作用,因此使其比线性双链模板更容易测序。 尽管双链 PCR 产物可以作为直接测序的模板(Wrischnik 等人,1987 年;Wong et al.,1987 年;Saiki 等人,1988 年),它们通常不会产生从双链质粒或单链 DNA 分子的测序中获得的那么多的可用序列信息(Engelke 等人,1988 年;Gyllensten 和 Erlich,1988 年;Stoflet et al.拓扑约束显然起到了减慢变性质粒 DNA 的重新结合的作用,因此使其比线性双链模板更容易测序。
单链 DNA 产物可以使用“不对称引发”方法通过聚合酶链反应合成。在“不对称引物”中,其中一个寡核苷酸引物的浓度显著降低,结果是该引物在早期复制周期中耗尽。在仅存在一种引物的情况下,扩增将不再呈指数级进行。相反,单链副本将由过量提供的引物制成。 单链 DNA 产物可以使用 "不对称引发 "方法通过聚合酶链反应合成。在 "不对称引物 "中,其中一个寡核苷酸引物的浓度显著降低,结果是该引物在早期复制周期中耗尽。在仅存在一种引物的情况下,扩增将不再呈指数级进行。相反,单链副本将由过量提供的引物制成。
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核酸探针的开发与应用
David A. Stahl 和 Rudolf Amann伊利诺伊大学兽医病理生物学系,2001 South Lincoln Avenue, Urbana, IL 61801, USA 伊利诺伊大学兽医病理生物学系,2001 South Lincoln Avenue,Urbana, IL 61801, USA
Another aspect of nucleic acid probe technology concerns detection systems. Although all early studies used (and most contemporary studies still use) radioactive probes, concerns of safety and versatility have fostered the development of a variety of non-radioactive detection systems. These techniques are essential adjuncts to hybridization. However, it would require an entire volume to describe and properly elaborate upon the various existing and evolving approaches for the detection of nucleic acid hybrids; certainly beyond the scope of a single chapter. As a com- 核酸探针技术的另一个方面涉及检测系统。虽然所有早期研究都使用(而且大多数当代研究仍在使用)放射性探针,但对安全性和多功能性的关注促进了各种非放射性检测系统的发展。这些技术是杂交的重要辅助手段。然而,要描述并适当阐述现有的和不断发展的各种核酸杂交检测方法,需要整整一卷书的篇幅;当然,这也超出了一章的范围。作为一
B. GENERAL CONSIDERATIONS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION B.核酸杂交的一般注意事项
The use of determinative nucleic acid hybridization (nucleic acid probes) must take into account the characteristic features of formation and breakdown of a specific double-helix. Most important is the balance between specificity of the reaction and detection of reaction product. The latter is largely dependent upon the detection system used (see below). Specificity and sensitivity are usually competing entities and must be balanced according to the determinative requirements. As an introduction to the applied sections, an overview of fundamental and practical aspects of nucleic acid hybridization is offered. The following is a collection of common terms and definitions applied to studies and descriptions of hybridization reactions (adapted from Lathe, 1985). 使用确定性核酸杂交(核酸探针)必须考虑到特定双螺旋形成和分解的特征。最重要的是在反应的特异性和反应产物的检测之间取得平衡。后者在很大程度上取决于所使用的检测系统(见下文)。特异性和灵敏度通常是相互竞争的,必须根据决定性要求加以平衡。作为应用部分的引言,本文概述了核酸杂交的基本和实用方面。以下是应用于杂交反应研究和描述的常用术语和定义集(改编自 Lathe, 1985)。
Complement. With reference to the Watson-Crick canonical base pairs, A pairs with T (or U ) and G pairs with C . The canonical base pairs are also referred to as complementary or as complements of each other (i.e. A is complementary to T). 互补。关于沃森-克里克碱基对,A 与 T(或 U)成对,G 与 C 成对。典型碱基对也被称为互补碱基对或互补碱基对(如 A 与 T 互补)。
Probe. A single strand of DNA or RNA, intended to hybridize with a complementary sequence (e.g. the coding sequence for a particular protein or stable RNA) in order to detect that sequence. Probes are synthesized both enzymatically and chemically (see below). 探针。DNA 或 RNA 单链,用于与互补序列(如特定蛋白质或稳定 RNA 的编码序列)杂交,以检测该序列。探针可通过酶法和化学法合成(见下文)。
Target. The target sequence for a probe is the complementary sequence to which the probe is designed to hybridize. 目标。探针的靶序列是指探针与之杂交的互补序列。
Match. ‘Match’ is generally used to refer to canonical pairing between probe and target at a specified position. ‘Match’ is also used to describe complete complementarity between probe and target sequences. 匹配。匹配 "一般指探针和目标物在指定位置上的典型配对。匹配 "也用于描述探针和目标序列之间的完全互补性。
Mismatch. A mismatch at a particular position occurs when the nucleotide in the probe does not complement the nucleotide at the same position in the target sequence (non-canonical pair). 错配。当探针中的核苷酸与目标序列中同一位置的核苷酸不互补(非经典配对)时,就会出现特定位置的错配。
Homology. The percentage homology ( hh ) between two sequences of identical length ( nn ) and containing a given number of mismatches ( mm ) is given by the expression h=100(n-m)//nh=100(n-m) / n. Similarity is now considered the semantically correct term for this value. However, for the purposes of this chapter the terms homology and similarity are used interchangeably. 同源性。两个长度相同( nn )且包含一定数量错配( mm )的序列之间的同源性百分比( hh )由表达式 h=100(n-m)//nh=100(n-m) / n 给出。相似性现在被认为是该值在语义上的正确术语。不过,在本章中,同源性和相似性这两个术语可以互换使用。
Stringency. Stringency describes the conditions of hybridization or the hybridization wash step. The greater the stringency of the hybridization or subsequent wash step (see below), the fewer, if any, mismatches remain in the duplex structure. 严格度。严格程度是指杂交或杂交洗涤步骤的条件。杂交或后续清洗步骤(见下文)的严格程度越高,双链结构中残留的错配(如果有的话)就越少。
Oligonucleotide. A short single strand of DNA (oligodeoxyribonucleotide) usually 6-50 nucleotides in length. 寡核苷酸。通常长度为 6-50 个核苷酸的 DNA 短单链(寡脱氧核苷酸)。
Duplex structure. Double-helix structure composed of antiparallel strands of DNA-DNA, DNA-RNA or RNA-RNA held in association by specific hydrogen bonding between the nucleotides comprising each strand. 双链结构。由 DNA-DNA、DNA-RNA 或 RNA-RNA 的反平行链组成的双螺旋结构,每条链上的核苷酸之间通过特定的氢键结合在一起。
(i) Melting point (i) 熔点
For determinative studies the single most important feature defining a given double-helix structure is its melting point (T_(m))\left(T_{m}\right). In this respect, the double helix structure has been likened to a one-dimensional crystalline lattice (Marmur and Doty, 1959). The breakdown of the helix (or crystal) occurs at a specific melting temperature and propagation of the helix (or growth of the crystal) follows a nucleation event (formation of a seed crystal or short duplex structure). However, with the exception of homopolymers (e.g. poly U-poly A), the double-helix structure does not dissociate (melt) completely at a specific temperature. Rather, denaturation proceeds over a temperature range. 对于确定性研究而言,定义特定双螺旋结构的唯一最重要特征是其熔点 (T_(m))\left(T_{m}\right) 。在这方面,双螺旋结构被比作一维晶格(Marmur 和 Doty,1959 年)。螺旋体(或晶体)在特定的熔化温度下分解,螺旋体的传播(或晶体的生长)遵循成核事件(种子晶体或短双链结构的形成)。然而,除均聚物(如聚 U 聚 A)外,双螺旋结构不会在特定温度下完全解离(熔化)。相反,变性是在一定温度范围内进行的。
The T_(m)T_{\mathrm{m}} is defined as the temperature corresponding to the mid-point in the transition from helix to random coil (frequently measured optically by monitoring the characteristic hyperchromatic shift of denaturation). In addition, the temperature range over which transition from helix to T_(m)T_{\mathrm{m}} 被定义为从螺旋过渡到无规线圈的中点所对应的温度(通常通过监测变性的特征性高色移进行光学测量)。此外,从螺旋过渡到无规线圈的温度范围为
random coil occurs varies significantly, depending upon length, nucleotide composition and ionic strength. The zipping (renaturation) or unzipping (denaturation) of the helix is influenced by nucleotide composition in the vicinity of base-pair formation or denaturation (GC-rich versus AT-rich regions). This effect and its influence on the observed transition temperature is referred to as cooperativity. At low ionic strength local compositional differences are suggested to contribute to a broadening of the transition range (Dove and Davidson, 1962). 由于长度、核苷酸组成和离子强度的不同,随机螺旋的形成也有很大差异。螺旋的拉链(再饱和)或解压缩(变性)会受到碱基对形成或变性附近核苷酸组成(富含 GC 与富含 AT 的区域)的影响。这种效应及其对观察到的转变温度的影响被称为合作性。在低离子强度下,局部成分差异被认为有助于扩大转变范围(Dove 和 Davidson,1962 年)。
(ii) T_(m)T_{m} versus T_(d)T_{d} versus T_(w)T_{w} (ii) T_(m)T_{m} 对 T_(d)T_{d} 对 T_(w)T_{w}
To this point, discussion has been restricted to long double-helix structures (greater than about 500 nucleotides in length). The temperature mid-point of the helix-to-random coil transition is the same for the formation or the breakdown of long duplexes. This is not true for oligonucleotides in duplex structure (e.g. bound to immobilized DNA). The dissociation temperatures T_(d)T_{\mathrm{d}} of short oligonucleotide hybrids, unlike longer complementary structures, is concentration dependent. Thus, under non-equilibrium conditions (such as temperature-dependent dissociation of membrane-bound probe) the observed mid-point in dissociation may be lower than a more thermodynamically rigorous determination of T_(m)T_{\mathrm{m}}. Another practical convention is the use of T_(w)T_{w}. This refers to the optimal temperature for washing at a specified monovalent cation concentration. In practice the T_(m)T_{\mathrm{m}} (or T_(d)T_{\mathrm{d}} ) and T_(w)T_{w} are frequently treated as equivalent. 到目前为止,讨论仅限于长双螺旋结构(长度超过约 500 个核苷酸)。从螺旋到随机线圈转变的温度中点对于长双链的形成或分解都是相同的。但双链结构中的寡核苷酸(如与固定 DNA 结合)则不然。与较长的互补结构不同,短寡核苷酸杂交体的解离温度 T_(d)T_{\mathrm{d}} 与浓度有关。因此,在非平衡条件下(如膜结合探针的解离与温度有关),观察到的解离中点可能低于更严格的热力学测定 T_(m)T_{\mathrm{m}} 。另一个实用惯例是使用 T_(w)T_{w} 。这是指在特定单价阳离子浓度下的最佳洗涤温度。在实践中, T_(m)T_{\mathrm{m}} (或 T_(d)T_{\mathrm{d}} )和 T_(w)T_{w} 经常被视为等价物。
(iii) Estimation of T_(m)T_{m} (iii) T_(m)T_{m} 的估算
1. DNA probes of greater than 50 nucleotides 1.超过 50 个核苷酸的 DNA 探针
The basic parameters for estimating the T_(m)T_{\mathrm{m}} of a given double-helix structure were established in the early 1960s and 1970s. Empirical relationships describing their contributions to T_(m)T_{\mathrm{m}} are summarized below. These relationships were derived from relatively large double-helix structures and so are of less value in predicting the behavior of short duplexes. However, slight modifications offer reasonable approximations of shorter duplex structure stability (see below). The following provides the reader with a rationalization for the equations used for estimating T_(m)T_{\mathrm{m}} and also a better feeling for the relative importance of those parameters that are routinely adjusted in nucleic acid hybridization reactions. 用于估算给定双螺旋结构的 T_(m)T_{\mathrm{m}} 的基本参数是在 20 世纪 60 年代初和 70 年代确立的。下文总结了描述它们对 T_(m)T_{\mathrm{m}} 贡献的经验关系。这些关系是从相对较大的双螺旋结构中推导出来的,因此对预测短双链的行为价值较低。不过,稍加修改就可以合理地近似预测较短双链结构的稳定性(见下文)。以下内容为读者提供了估算 T_(m)T_{\mathrm{m}} 所用方程的合理性,同时也让读者更好地了解核酸杂交反应中常规调整参数的相对重要性。
Ionic strength. The T_(m)T_{\mathrm{m}} (in degrees Celsius) of DNA increases linearly with the logarithm of the ionic strength and is independent of the base ratio of the DNA (Dove and Davidson, 1962; Schildkraut and Lifson, 1965): 离子强度。DNA 的 T_(m)T_{\mathrm{m}} (摄氏度)随离子强度的对数线性增加,与 DNA 的碱基比率无关(Dove 和 Davidson,1962 年;Schildkraut 和 Lifson,1965 年):
where M_(1)M_{1} and M_(2)M_{2} are the respective ionic strengths of the two solutions. 其中 M_(1)M_{1} 和 M_(2)M_{2} 分别是两种溶液的离子强度。 G+CG+C content. The effect of base composition on the thermal denaturation of DNA was early observed and has served as the basis for determining the %(G+C)\%(\mathrm{G}+\mathrm{C}) content of microorganisms (Marmur and Doty, 1959): G+CG+C 含量。人们很早就观察到碱基组成对 DNA 热变性的影响,并以此为基础确定微生物的 %(G+C)\%(\mathrm{G}+\mathrm{C}) 含量(Marmur 和 Doty,1959 年):
The above relationship was derived for solutions of DNA in 1xx1 \times SSC (standard saline citrate (SSC) contains 0.15 M sodium chloride and 0.015 M trisodium citrate). 上述关系是针对 DNA 在 1xx1 \times SSC(标准柠檬酸盐(SSC)含有 0.15 M 氯化钠和 0.015 M 柠檬酸三钠)中的溶液得出的。
The first equation combining the observed dependence of T_(m)T_{m} on both the salt concentration (M)(M) and the %(G+C)\%(G+C) was formulated by Schildkraut and Lifson (1965): Schildkraut 和 Lifson(1965 年)提出了第一个方程,将观察到的 T_(m)T_{m} 对盐浓度 (M)(M) 和 %(G+C)\%(G+C) 的依赖性结合起来:
Percentage of mismatched base pairs. A 1%1 \% base pairing mismatch corresponds to about a 1-1.5^(@)C1-1.5^{\circ} \mathrm{C} decrease in T_(m)T_{\mathrm{m}} (Bonner et al., 1973; Ausubel et al., 1987). The rate of DNA reassociation is approximately halved (at the optimum temperature for reassociation) for every 10^(@)C10^{\circ} \mathrm{C} reduction in T_(m)T_{\mathrm{m}} (Bonner et al., 1973). 错配碱基对的百分比。 1%1 \% 碱基配对错配大约相当于 T_(m)T_{\mathrm{m}} 减少 1-1.5^(@)C1-1.5^{\circ} \mathrm{C}